基于TILLING技术的宁夏水稻耐盐种质创新研究

针对宁夏水稻生产面临农业用水日益紧缺、土壤盐渍化日益严重、缺乏有效的改良盐碱土措施，以及水稻育种中耐盐种质资源缺乏等问题，将TILLING(定向诱导基因组局部突变)技术引入耐盐水稻种质创新中。以现有的化学诱变剂EMS（甲基磺酸乙酯）处理获得的1500份M2代为材料，根据已克隆水稻耐盐主效基因SKC1基因设计特异引物，利用高效的TILLING检测技术分析突变位点，获得耐盐突变体；通过测序验证突变体；进行盐碱地田间耐盐试验及盆栽试验，鉴定突变体的耐盐性，筛选出生产利用的新品种，或用于耐盐育种的新种质。相对于常规回交转育及转基因育种，本研究具有稳定快，成本低，可操作性强等优点。因此，通过该项目研究，可建立TILLING技术宁夏利用技术体系；解决宁夏水稻生产中耐盐品种缺乏问题；加快宁夏水稻耐盐种质资源创新与品种选育，拓宽育种途径，提高育种效率。

本项目根据已克隆的水稻耐盐主效基因SKC1设计了5对特异引物，通过筛选确定了覆盖该基因全长的3对特异性强的引物，送国外合成了带荧光的TILLING引物。根据TILLING技术原理，按照TILLING技术操作步骤对经过化学诱变剂EMS（甲基磺酸乙酯）处理获得的1310份M2代水稻材料进行突变位点检测，这些M2代材料包含5个品种：宁粳28号、宁粳38号、宁粳41号、花109（宁粳45号）和花114。经过2011-2012年两年M2、M3代的连续检测及测序分析，检测到4个突变位点，分别是：423（G→A）、491（C→T）、674（C→T）、1039（G→T），4个位点碱基变化引起的氨基酸改变分别是：不变、Ｐ（脯氨酸）→Ｌ（亮氨酸）、Ｔ(苏氨酸)→Ｍ（蛋氨酸）、Ｒ（精氨酸）→Ｌ（亮氨酸），表明423位的突变是同义突变（只发生碱基改变而没有引起相对应氨基酸改变），其它3个突变位点是错义突变（碱基和氨基酸都发生改变）。这些位点分布在宁粳28号、宁粳38号和花109（宁粳45号）三个品种中，品种宁粳41号和品系花114没有检测到突变位点。.根据测序图谱分析了突变位点的杂合/纯合性，位点423和1039既有杂合突变也有纯合突变，对应品种为宁粳38号，而位点491和674只得到了杂合突变，对应品种为花109和宁粳28号，不同品种的突变位点不同，表明EMS诱导的基因突变与基因型有一定相关性。获得SKC1基因纯合突变体5份，杂合突变体14份。纯合突变可以稳定遗传，杂合突变后代会继续分离。.利用公式（突变率=突变体数（位点）/样品数×基因长度）对突变频率进行了统计，总突变率为4/1310*1.6KB=1.9/MB，不同品种（系）的突变率有差异。.2013年对5份纯合突变株进行盐碱地田间鉴定和发芽期耐盐鉴定，以未诱变处理材料和当地生产品种为对照，结果表明12TM11-1和12TM13-2两份材料的保苗率和成株率均明显高于未处理对照和当地生产品种，而株高、分蘖、穗长、千粒重、结实率等性状没有明显变化，这两份材料都是错义突变体，其它3份材料（同义突变）表现不及对照，试验结果符合预期。发芽期耐盐鉴定结果材料12TM13-2的相对盐害率好于对照，其它材料略好于对照或与对照相当。.经过3年的研究，本项目完成了计划任务，建立了水稻耐盐基因SKC1突变体的TILLING技术检测平台，发表学术论文3篇。