基于大规模PCR技术高通量制备DNA疫苗方法的研究

随着国内外一些DNA疫苗相继进入临床试用阶段，通过PCR获得线性DNA疫苗的方法因其产物具有与质粒DNA相同的免疫功能，而又避免了质粒DNA生产中一些不利因素而得到研究者的亲睐。目前，若通过常规获PCR方法获得线性DNA疫苗，则会因DNA聚合酶成本及生产规模的局限，导致线性DNA疫苗的制备成本高和速率慢而限制其应用。鉴于此，本研究拟在已研制出酵母分泌表达的高效DNA聚合酶和初步建立的较大规模PCR方法的基础上，进一步优化RKOD酶的特性和扩增条件，建立大规模PCR技术高通量获得大量线性DNA疫苗，同时利用无限制（RF）克隆法或cre／Loxp定位重组系统获得大量环状DNA疫苗。通过详细解读基于大规模PCR生产线性DNA疫苗及其与RF克隆方法或cre／Loxp定位重组系统的形成微环DNA生产方式的机制，可为深入探讨无细胞高通量制备DNA疫苗而应对新发传染病的预防模式提供重要的参考和指导意见。

随着国内外一些DNA疫苗相继进入临床试用阶段，通过PCR获得线性DNA疫苗的方法因其产物具有与质粒DNA相同的免疫功能，而又避免了质粒DNA生产中一些不利因素而得到研究者的亲睐。目前，若通过常规获PCR方法获得线性DNA疫苗，则会因DNA聚合酶成本及生产规模的局限，导致线性DNA疫苗的制备成本高和速率慢而限制其应用。鉴于此，在该项目经费的支持下，课题组在毕赤酵母中高效表达了DNA聚合酶RKOD。通过调节诱导表达条件，获得了性能优异的DNA聚合酶RKOD并初步建立了较大规模PCR方法。进一步优化RKOD酶扩增条件后，建立了每次产量可达1000ml以上大规模PCR方法。然后利用建立的大规模PCR获得了流感病毒H1N1的HA蛋白的普通或修饰引物（核定位修饰和硫代修饰）扩增的DNA线性疫苗免疫小鼠，实验结果显示，大规模PCR方法制备的线性DNA疫苗，具有诱导免疫小鼠获得较强免疫应答水平。同时证实，经过修饰PCR扩增引物的方法，可以提高大规模PCR方法获得的线性DNA疫苗诱导的免疫水平，增强免疫小鼠抵抗致死剂量病毒攻击的能力。课题组还表达了重组酶Cre，利用cre／Loxp定位重组系统获得了环状DNA产物，为进一步探讨体外获得大量环状DNA疫苗奠定了基础。同时，该项目的开展还有效地带动了利用酵母、大肠杆菌展示(膜展示、ghost荷载)、质体（主要是叶绿体）等系统表达流感病毒HA抗原、单链抗体及新型疫苗等相关研究的开展。该项目的开展也促进了课题组的人员的国际学术交流和相关技能的培养，支持课题组成员参加国内会议6次。由课题资助获得相关研究已发表文章8篇，其中SCI5篇，中文3篇，授权相关专利1篇，培养硕士研究生5名，在读博士研究生2名，感谢国家基金对本项目的大力资助。该项目相关结果发表在《PLoS One》、《J Environ Sci Health B》、《Acta Virol》等杂志上，授权专利一项。通过详细解读基于大规模PCR生产线性DNA疫苗及其与cre/Loxp定位重组系统的形成微环DNA生产方式的机制，可为深入探讨无细胞高通量制备DNA疫苗而应对新发传染病的预防模式提供重要的参考和指导意见。