用正常人肝细胞创建肝癌肿瘤干细胞

肿瘤干细胞参与了肿瘤的复发或远处转移以及肿瘤对化疗和放疗的抵抗，然而由于实体肿瘤的异质性，还没有可靠的方法进行肿瘤干细胞的分离与鉴定。最近有报道称，引入一组核心核编程因子可以使体细胞核再编程后转化为诱导性多能干细胞，同时 p53肿瘤抑制途径的失活有利于这一再编程过程。鉴于肿瘤细胞和干细胞的基因表达谱和表型特点高度相似，我们推测干细胞的再编程在肿瘤的发生发展中具有重要作用，我们拟将体细胞核再编程与多能干细胞传代原则相结合，建立从正常肝细胞株创建肝癌干细胞的方法，确定由正常肝细胞创建肝癌干细胞所必需的因子，揭示核再编程过程是否在肝癌的发生中发挥重要作用，并筛选出可用于肝癌干细胞鉴定的细胞膜表面标志物。

目的：肿瘤干细胞参与了肿瘤的复发或远处转移以及肿瘤对放化疗的抵抗。最近的研究表明，引入一组核心核编程因子可以使体细胞核再编程后转化为诱导性多能干细胞，同时 p53 肿瘤抑制途径的失活有利于这一过程。鉴于肿瘤细胞和干细胞的基因表达谱和表型特点高度相似，我们推测肿瘤干细胞的形成可能涉及细胞核重编的机制。为此，我们设计通过引入2-3种核重编因子到正常肝细胞和/或肝癌细胞，可能诱导产生肝癌干细胞，并以此探索正常肝细胞的恶性转化机制及肝肿瘤干细胞的产生机制。.方法：1.免疫组化分析85例肝癌患者的组织样本中核转录因子的表达；2.构建基于口蹄疫病毒2A序列EGFP标记的非融合表达质粒，在细胞中非融合共表达Sox2，c-Myc、HBX；3.通过测序、酶切验证所构质粒的基本结构和大小，再将已成功构建的质粒转染293细胞对核重编因子进行验证；4.将成功构建的质粒转染肝癌细胞株HepG2，筛选稳定表达质粒的细胞株并验证；5.稳定表达转染基因的细胞株的生物学走向对稳定表达多基因载体的肝癌细胞株进行体内、外肿瘤生物学行为进行的广泛验证。.结果：1. 免疫组化分析发现85例肝癌患者样本中，OCT4、Sox2和Nanog表达呈阳性的比例分别为34%、19%和5%，并且29例OCT4表达阳性的病人中18例Sox2表达阳性，4例Nanog表达阳性;；2.经测序和酶切鉴定基于2A序列构建的重组质粒pEGFP-XSM、pEGFP-SM、pEGFP-HBx的结构和酶切片段大小符合预期结果；3.检测在瞬时转染重组质粒pEGFP-XSM、pEGFP-SM的293细胞和HepG2细胞中c-myc和Sox2的表达符合预期的大小，但在稳定表达转染基因的HepG2细胞中c-myc和Sox2的蛋白表达有差异；4.在细胞生长，周期，凋亡，迁移等方面，肝癌稳定株细胞与HepG2对照组有明显的差异(P<0.05)；5.成瘤实验中，与HepG2对照组相比，肝癌稳定株细胞Stable-1成瘤及转移能力较强，稳定株Stable-5较弱。.结论：病人癌组织组化分析结果发现几种核重编因子均有不同程度的表达且相互之间具有协同性；将基于2A序列构建的能非融合表达c-myc和Sox2的共表达质粒转染肝癌细胞，由于单克隆株的异质性我们最终分离到性状不同的单克隆细胞株，并发现其与原始肝癌细胞相比在细胞生物学特性和体内成瘤能力方面均有差异。