微流控辅助的脉冲电场-超声协同处理对内生孢子的灭活机理研究

In order to reduce the food safety risks caused by the stress resistance of endospore during food processing, as well as to decrease the limitation of mechanism study of pulsed electric field and ultrasound technologies, we proposed a topic to study the synergistic effect of pulsed electric field and ultrasound technologies on inactivation of bacterial endospores by a microfluidic chip. Based on physics, microbiology, molecular biology and chemometrics knowledge, a self-fabricated microreactor is designed, in which both pulsed electric field and ultrasound act simultaneously on the endospores. Numerical simulation is applied to develop a multi-physics coupled model of the synergistic effect of pulsed electric field and ultrasound technologies on the poration of single bacterial endospore, with the objective of studying the effect of multiple parameters on the local structural damage of endospore. Laser tweezers Raman spectroscopy and fluorescence imaging are used to quantify the potation effect of single bacterial endospore under the treatment of both pulsed electric field and ultrasound, to realize the validation of microelectroporation and microsonoporation at the molecular level. Finally, the mechanism of synergistic effect of pulsed electric field and ultrasound technologies on the poration of single bacterial endospore is revealed. This research will promote the application of non-thermal technologies on food processing and provide a solid foundation for the large-scale application in the field of food safety and public health.

针对食品加工过程中细菌内生孢子的较强抗逆性所带来的食品安全风险，以及目前脉冲电场和超声波技术作用机理研究的局限，探究脉冲电场-超声协同处理对内生孢子的灭活机理是非常必要的。根据微流控芯片技术在单细胞表征和分析方面的优势，本项目拟综合利用物理学、微生物学、分子生物学和化学计量学等领域的知识，以自主设计研制的微反应器为载体，采用脉冲电场-超声协同处理技术，解决非热加工技术对食品中内生孢子灭活方面的局限性；通过数值模拟方法构建微反应器内单个内生孢子穿孔效应的耦合模型，获得复杂多因素对于内生孢子细胞结构的破坏规律；探索荧光标记成像法和激光光镊拉曼光谱技术对细胞内标物的定量检测方法，实现对内生孢子穿孔效应在分子水平上的实时验证，从而解释脉冲电场-超声协同处理对于内生孢子的灭活机理，实现非热加工技术的进一步发展和应用，为其在食品安全及公共卫生领域的广泛应用奠定基础。

针对目前脉冲电场和超声波技术作用机理研究的局限，发明了一种可实现超声波和脉冲电场同时作用于微生物细胞的微型处理室，利用该微处理室分别研究了两种技术顺序和同时施加对微生物细胞的灭活效果。实验结果表明，超声和脉冲电场两种技术同时作用的灭菌效果要优于顺序作用灭菌效果，同时大于两种技术单独作用灭菌效率的代数和，存在协同效应,并通过透射电子显微镜观察和分析不同处理条件对微生物细胞膜和膜内结构的破坏作用。设计了一种无电解的微流控电穿孔（NEME）芯片，通过使用有限元分析软件分析了几何参数，材料特性以及输入电压对NEME芯片性能的影响，在一定范围内，当使用的介电质材料介电常数越大，交流电频率越高，电极间距越小，溶液电导率越小，则芯片的‖E‖max越强，A1000越大，直至饱和。分析了流过NEME芯片表面的微生物粒子运动轨迹，发现介电泳力和电穿孔现象可以在芯片上同时发生并可用施加的交变电场频率进行控制。这一现象可以广泛应用于生物技术和医学中，例如细胞的分离，对细胞的选择性杀灭，或是从多种细胞混合液中对特定的细胞进行分离和转染。在4个IGBT并联的基础上，成功研制了4并64串共计256个IGBT单管堆叠组成的高功率固态开关。对搭建的高功率固态开关进行性能测试，证明该固态开关可以在35 kV/150 A的条件下稳定工作，基于该固态开关搭建的脉冲电源可以输出幅值1 kV ~ 35 kV、脉宽3 μs ~ 10 μs、频率100 Hz ~1000 Hz可调的准方波脉冲。根据理论和试验研究成果，在国外学术期刊上发表SCI收录论文2篇，授权国家发明专利4项，申请受理国家发明专利3项，软件著作权登记1项，通过项目培养博士研究生2名，硕士研究生1名。