线粒体介导的乳酸-乳酸脱氢酶体系调控冷却牛肉色泽稳定性机理研究

The apparent color stability of fresh beef is a crucial physical attribute during chilled storage and retail, and Lactate enhancement results in minimizing surface discoloration in injection-enhanced meat products. Lactate-LDH by mitochondrial mediated is the most likely system responsible for generating NADH for metmyoglobin-reducing activity (MRA), but the specific mechanism is unclear. The project intends to systematically study the effect of Lactate-LDH system on color stability in Post-mortem chilled mutton in situ and in vitro, determine the influence of lactate enhancement on LDH enzyme activity,NADH concentration, and MRA, examine the interaction of lactate and LDH to reduce MMb in vitro, Quantitative measurement of the redox state of myoglobin in mutton via electron paramagnetic resonance(EPR), characterize the involvement of LDH isoenzymes in MMb reduction and investigate the effects of LDH Inhibition by oxamate on replenishment of NADH and MRA of meat muscles. Based on assays, to reveal the mechanism of Lactate-LDH system on color stability in Post-mortem chilled beef during aerobic storage. The mechanism will be investigated by EPR spectroscopy, MALDI-TOF-MS, 2-D PAGE, and Western-blotting techniques. Finally, the research results will provide a theoretical reference for development a new technology of minimizing surface discoloration.

冷却肉贮藏和零售过程中的表观色泽稳定性至关重要，通过乳酸盐注射增强技术可有效控制有氧贮藏期间冷却肉的褪色。线粒体介导的乳酸-乳酸脱氢酶系统会促进NADH的再生进而提高高铁肌红蛋白的还原，导致货架期肉色的改善，但具体还原机理尚不清楚。本项目拟以有氧储藏条件下的冷却牛肉为试验材料，采用原位模型和离体模型，研究利用电子顺磁共振波谱技术定量分析冷藏期间肌红蛋白不同氧化状态的变化规律；使用双向电泳结合Western-blotting技术分离和筛选骨骼肌中LDH蛋白，建立LDH同工酶谱，考察LDH抑制剂对表面肉色、LDH活性以及对NADH浓度的影响；研究不同乳酸盐诱导下的乳酸-乳酸脱氢酶系统对牛肉中MetMb还原作用的效果、途径和机理，揭示不同LDH活性与MRA的相关性及其再生NADH的调控机理，探寻宰后冷却牛肉色泽品质的变化规律，为研发控制肉色劣变的新技术提供理论参考。

冷却肉贮藏和零售过程中的表观色泽稳定性至关重要，通过乳酸盐注射增强技术可有效控制有氧贮藏期间冷却肉的褪色。但乳酸-乳酸脱氢酶（LDH）体系影响肉色的具体还原机理尚不清楚。本项目以牦牛背最长肌为主要研究对象，采用原位模型和体外孵化模型相结合的方法，明确了乳酸- LDH体系中关键因子对肉色稳定性的影响。揭示了线粒体介导的乳酸-LDH 体系对牦牛肉色稳定性的影响机理。主要研究结果如下:1.0.3 %的乳酸盐（乳酸钙、乳酸钾、乳酸钠）对稳定和保持肉色具有较好的作用，可以抑制牦牛肉糜 a*值的下降，但会使肉色变暗。添加0.3 %的 CaL 对稳定和保持牦牛肉色的作用最明显。2.牦牛在宰后无氧状态下，LDH 通过再生 NADH 而在 MMb 还原中发挥特定的作用，从而影响牦牛肌肉的颜色稳定性。3.乳酸钙处理组线粒体膜体通透性、SDH 活性、线粒体膜电位均与 a*值具有极显著的正相关性，表明宰后牦牛肉线粒体代谢与肉色稳定性有关。4.离体孵育的Mb在不同光谱下，乳酸钙对 Mb 分子中的血红素辅基影响较小，与肌红蛋白的血红素铁卟啉环并未直接发生反应但与 Mb 血红素中心Fe 原子发生配位。明确乳酸盐和 Mb 的共价加合作用并未发生在血红素辅基上，而有可能通过非血红素配体结合的方式来调节 Mb 的功能。5.由 LDH 形成的NADH 不能在没有还原酶或电子载体的情况下还原 MMb。除了电子传递链介导的非酶促还原外，CaL-LDH-NAD 体系产生的 NADH 也可用于线粒体内的酶促 MMb 还原。最终通过乳酸盐的氧化过程由 ETC 产生的电子是导致 MMb 还原的原因，线粒体的还原当量影响氧消耗、MMb 还原、Mb 氧化还原状态和牛肉颜色的稳定性。综上，本项目通过添加外源乳酸盐对乳酸-LDH-NAD 体系进行调控，使牦牛骨骼肌线粒体氧化乳酸盐，NADH 库再生并伴随 MMb 的还原进而稳定牦牛肉的色泽，为延缓宰后生鲜牦牛肉色泽劣变、延长牦牛肉货架期提供了重要的理论依据，为乳酸盐在肉及肉制品中的实际应用提供了理论参考，也为可食用包装体系基材选用提供了新思路。