灰毡毛忍冬HQT基因在绿原酸生物合成中的功能解析

Chlorogenic acid(CGA) , the main secondary metabolite and bioactive component in Lonicera macranthoides ,is widely concerned for its role in antibiotic property, antioxidation and anti-tumour effects, which encourages the development of strategies such as genetic improvement to increase CGA levels in plants. Evidents showed that hydroxycinnamoyl-CoA quinate hydroxycinnamoyl transferase(HQT)is a key enzyme in the biosynthetic pathway for generating CGA, however, there was no report related to the function of HQT gene in Lonicera macranthoides .we recently found that the contents of chlorogenic acid were different at different developmental stages in various tissues, and were positively correlated with transcript levels of HQT gene. We hypothesized that HQT gene may be involve in CGA biosynthesis in Lonicera macranthoides .In this project, Real time Quantity PCR and subcellular localization technologies will be employed to determine temporal and spatial expression patterns; Agrobacterium mediated genetic transformation technology system will be established based on the mature technique of regeneration in vitro developed in our early experiments; Genetic tools including gene overexpression and RNA interference (RNAi) will be applied to analyze the function of HQT gene thoroughly in vivo.The results will help to understand the function of this gene in CGA biosynthetic pathway, and provide evidence for genetic improvement involving in CGA biosynthesis in woodbind and other trees.

绿原酸是灰毡毛忍冬的主要次生代谢产物和药效成分，因其具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤等功能而受到越来越多的关注，通过遗传改良提高其含量具有诱人的应用前景。证据表明HQT(羟基肉桂酰辅酶A奎宁酸苯丙酰基转移酶)基因是绿原酸生物合成的关键酶基因，目前国内外尚无灰毡毛忍冬HQT基因功能的研究报道。我们前期研究发现，灰毡毛忍冬绿原酸含量具有明显时空特异性，且与HQT基因的表达量呈正相关，暗示着该基因在绿原酸合成中起重要作用。本研究拟利用qRT-PCR和亚细胞定位技术明确该基因的时空表达模式；在前期成熟的离体再生技术基础上，构建其遗传转化技术体系；通过超量表达和干扰表达在灰毡毛忍冬上深入开展基因功能研究。研究结果将明确灰毡毛忍冬HQT基因在绿原酸合成中的功能，还将为忍冬及相关林木绿原酸合成的遗传改良提供依据。

绿原酸是灰毡毛忍冬的主要次生代谢产物和药效成分，因其具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤等功能而受到越来越多的关注，通过遗传改良提高其含量具有诱人的应用前景。大量证据表明HQT基因是绿原酸生物合成的关键酶基因，但灰毡毛忍冬中HQT基因的功能挖掘研究甚少。.项目以灰毡毛忍冬花、叶、茎为对象开展时空表达特性、转录组及表达谱分析、离体再生技术体系和遗传转化体系等研究。结果表明：（1）通过HPLC-DAD法建立了一种可同时测定灰毡毛忍冬中7种多酚类物质的检测方法，系统研究了7个典型性花期以及3个叶片、3个茎段不同发育时期中多酚含量，明确了其时空表达特征。（2）通过转录组测序，获得了76453个平均长度为703bp的unigenes。基于KEGG的功能分类表明，共有84条unigenes被认为可能与绿原酸的生物合成相关。利用RNA-seq分别对3个组织进行测序，共发现有691个基因序列在3个组织两两间均差异表达，结合不同组织间差异表达情况，涉及6个PAL基因、6个4CL基因、4个C4H基因、7个HCT/HQT基因及1个C3H基因共24个差异表达基因被发现。进一步对绿原酸生物合成的关键基因HCT/HQT基因进行进化树分析，1个unigene基因与忍冬HQT基因高度相似，3个unigene则与其他物种的HCT基因相似度较高。（3）建立了灰毡毛忍冬再生技术体系，包括诱导培养基MB + 1.0 mg L-1 6-BA + 0.2 mg L-1 NAA，增殖培养基MB + 1.0 mg L-1 6-BA + 0.5 mg L-1 IAA和生根培养基1/2MB + 2.0 mg • L-1 IBA + 0.2 mg • L-1 IAA。构建pcambia-1301-LmHQT超表达体系，并转入农杆菌EHA105。根癌农杆菌介导方法转化外植体，gus 染色和PCR检测报告基因。侵染时间8 min 能获得较理想的转化效果，35 mg /L 的卡那霉素和600 mg /L头孢霉素能得到很好的筛选效果。对转基因植株进行gus染色和PCR检测，结果表明gus 基因已整合到灰毡毛忍冬基因组中。对转基因植株的绿原酸含量检测发现pCambia2301-LmHQT1转基因中的含量上升了约60%。该结果证明了LmHQT1参与到了灰毡毛忍冬CGA的合成及累计过程中，也为提高灰毡毛忍冬CGA含量提供了新的品种材料。.