去分化间充质干细胞在脑胶质细胞瘤基因治疗中的应用研究

MSC mediated gene delivery has been shown to be a promising strategy for improving the efficacy and minimizing the toxicity of gene therapy approaches in the treatment of glioma. However, for clinical applications, it would be desirable if a sufficient quantity of engineered MSCs that localize within tumors is achieved. This requires the development of methods to improve the migratory capacity of MSCs to tumors, which would thereby increase the delivery of the therapeutic genes...Interestingly, previous studies from both our group have demonstrated that after neuronal commitment, differentiated rat bone marrow derived-MSCs can be induced to dedifferentiate and revert back to MSC morphologically under appropriate condition. In addition, we have shown that these dedifferentiated MSCs (rDe-neuMSCs) exhibit enhanced cell proliferation and cell survival. Furthermore, we have revealed that rDe-neuMSCs express significantly higher levels of chemokines and cytokines, and display enhanced tropism to cancer. We therefore propose to conduct a study to investigate the therapeutic effects of dedifferentiated human bone marrow-derived MSCs (hDe-neuMSCs) on the glioma targeted gene therapy. Our aims are: (1) determine the phenotypes of hDe-neuMSCs in vitro; (2) determine the effects hDe-neuMSCs for malignant glioma in vivo; (3) analyze the mechanisms underlying the tropism of hDe-neuMSCs for glioma, and (4) evaluate the therapeutic efficacy of TK-hDe-neuMSCs in xenograft intracranial models of glioma..The outlined studies will provide a better stem cell vehicle to deliver therapeutic proteins to brain tumors which represents a major step forward in enhancing treatments of patients with the deadly disease for whom only minimally-effective therapies are currently available。

如何提高MSCs在体内的靶向性和稳定性，是干细胞肿瘤基因治疗领域亟待解决的关键问题。我们的研究结果发现，经神经分化后再去分化的大鼠源性的MSCs具有高增殖，高存活，对肿瘤细胞高趋向性等特性。本课题旨在前期工作的基础上，深入研究人源性去分化MSCs在脑胶质瘤基因治疗中的作用机制。主要研究内容包括：(1) 研究去分化人源性间充质干细胞 （hDe-neuMSCs）的生物学特性 (2) 动态观察hDe-neuMSCs在荷瘤鼠体内的分布情况和对肿瘤的趋向性(3) 明确相关肿瘤生长因子及其受体在促进hDe-neuMSCs向胶质瘤细胞特异性迁移中的作用(4)观察和评估携带HSV-TK自杀基因的hDe-neuMSCs与GCV联合作用对胶质瘤的杀伤作用。本课题的完成，将为利用hDe-neuMSCs进行胶质细胞瘤的基因治疗奠定科学基础，为进一步探索肿瘤干细胞基因治疗提供新的载体系统和靶向性治疗策略。

本研究拟采用干细胞生物学﹑分子生物学和分子影像技术，分别通过体外和在体模型研究经神经诱导分化后再去分化的MSCs（De-neuMSCs）对脑胶质细胞瘤的趋向性。并进一步探究携带CD-5FC自杀基因的人源性De-neuMSCs对荷瘤鼠体内肿瘤的杀伤作用和机理。.我们首先建立了一套稳定、高效的诱导人源性骨髓间充质干细胞去分化的技术体系。并明确了人骨髓间充质干细胞在去分化以后具有和大鼠间充质干细胞同样的细胞表型，即具高分化，高存活的特性。另外，去分化后的间充质干细胞迁移能力明显增强，对肿瘤细胞具有更强的趋化能力。.接着，我们采用脑内移植胶质瘤的模型来研究De-neuMSCs在体内的趋化性。我们利用GFP荧光标记的大鼠MSCs检测在体内的迁移途径，发现在对侧种植GFP阳性的干细胞，能大量地向对侧迁移。然而去分化后的间充质干细胞对肿瘤的归巢能力大大增强。.通过系统性的干细胞功能机制研究，进一步解析了CCL5/CCR1/ERK 通路在去分化间充质干细胞向胶质瘤细胞特异性迁移中的作用。更有意思的是，经过去分化处理后，间充质干细胞的组蛋白修饰发生显著改变。其中与基因激活相关的组蛋白修饰在一些特异性趋化因子的启动子位置的结合明显上调，提示了表观遗传的改变导致了去分化细胞中趋化因子的表达更容易被上调。其中最为明显的就是组蛋白乙酰化（H4AC）。.最后我们建立了自杀基因系统并检测了去分化细胞作为基因载体对脑胶质瘤的杀伤作用。与未处理MSC相比，在裸鼠体内，去分化细胞在携带了自杀基因后，能更好地发挥肿瘤杀伤作用。后续的切片发现去分化细胞在肿瘤组织中能明显地杀伤肿瘤细胞，其中TUNEL染色和凋亡基因BAX表达明显上调。.本研究首次发现了MSCs经神经分化后再去分化，具有更强的向肿瘤组织迁移的能力和存活能力，并证实去分化可以提高MSCs作为肿瘤基因靶向治疗的有效载体。另外，本研究首次发现表观遗传的调控可以控制间充质干细胞的趋化性因子的分泌，并进一步改变它们的趋化性。该发现对于有效提高间充质干细胞在再生医学和肿瘤靶向治疗中的治疗效果具有指导意义。