三聚氰胺对雄性仔猪的生殖毒性作用及机理研究

The occurrence of melamine (MA) poisoning in the worldwide made people aware of the great harm of MA to animals and human. In recent years, a large number of studies have been performed on the MA toxicity and mechanism. In the previous studies, we have found that MA could damage the structure of the BTB and cause spermatogenic dysfunction. Whether MA could disrupt BTB and then induce reproductive toxicity in pig is not clear. In this project, we intend to evaluate the toxicity of MA on male reproductive system in piglets after MA exposure in vivo.On this basis, the isolation and culture of primary Sertoli cells are performed in porcine to observe the in vivo and in vitro effect of MA on the BTB function with biological tracer and cell resistance meter; then we will further examine the changes of the BTB morphology and related molecules with electron microscopy, immunofluorescence and Western blot, expecting to reveal the MA action target in the blood-testis barrier.Our expected results will help to understand the mechanism of MA male reproductive toxicity, and provide a theoretical basis for assessing the impact of MA on animal and human health.

世界范围内频繁发生的三聚氰胺（melamine，MA）中毒事件使人们意识到MA对动物和人类健康的巨大危害。近年来，人们对MA的毒性作用及机理进行了大量的研究。本项目前期研究发现，MA可损伤小鼠的血-睾屏障诱导生精功能障碍。那么，MA是否会通过损伤猪的血-睾屏障引发生殖毒性作用，至今尚不清楚。本项目拟对雄性仔猪进行MA体内染毒，系统评价MA对雄性仔猪的生殖毒效应，在此基础上，分离培养仔猪原代支持细胞，利用生物示踪和细胞电阻仪分别在体内和体外观察MA对血-睾屏障功能的影响；利用电镜、免疫荧光和Western blot观察构成血-睾屏障各成分的形态结构及相关分子的表达变化，以期揭示MA对血-睾屏障损伤的靶作用位点。预期结果将为深入认识MA对动物雄性生殖系统的毒性作用及机理提供理论依据，为正确评估MA对动物和人类健康的危害奠定基础。

本项目旨在研究MA对雄性仔猪的生殖毒性及机制。将48只健康的断奶仔猪随机分为4组，分别为对照组、低剂量组（100 mg/kg）、中剂量组（300 mg/kg）及高剂量组（1000 mg/kg），每组12只，以饲喂方式连续染毒10周。染毒期间，观察仔猪的临床症状，测定体重变化并采血，染毒结束后第1 d、7 d和14 d取材，通过检测脏器系数、血清生化测定、组织病理学变化、MA残留量及睾丸标志酶活性等，评价MA的雄性生殖毒效应；进一步采用透射电镜、硝酸镧示踪、western blot等方法，对血-睾屏障超微结构、渗透功能、构成血-睾屏障关键蛋白的表达进行分析，评价MA对断奶仔猪血-睾屏障结构和功能的影响。以分离培养的仔猪原代支持细胞为研究对象，采用CCK-8试验、PCR、透射电镜和western .与对照组相比，各处理组仔猪的体增重未见显著变化（p＞0.05）；中、高剂量组肾脏脏器系数显著升高（p＜0.05），同时，AST和ALT活性显著升高（p＜0.05），BUN浓度显著升高（p＜0.05）；各组血清睾酮水平显著下降（p＜0.05），睾丸和附睾的形态结构出现明显病变。HPLC-MS/MS检测结果显示，处理组的血清和睾丸组织中均检测到MA，且呈剂量依赖关系；与对照组相比，各组睾丸标志酶活性未见显著变化（p＞0.05）。透射电镜观察显示，MA破坏构成血-睾屏障的管周肌样细胞和支持细胞间连接复合体。硝酸镧示踪结果表明，MA处理的睾丸组织中硝酸镧可跨过血-睾屏障进入生精小管的顶端室。Western blot显示，MA显著下调ZO-1、occludin、connexin-43和N-cadherin的表达（p＜0.01），显著上调磷酸化的p-38、Erk和JNK表达（p＜0.01）。CCK-8试验表明支持细胞对MA毒作用较敏感，电镜和western blot发现MA可导致细胞间紧密连接结构消失，并显著诱导紧密连接蛋白occludin和JAM表达下调（p＜0.01），同时Erk、p-Erk、p-JNK及p-p-38表达上调（p＜0.01）。.综上，MA可诱导断奶仔猪血清睾酮水平降低，损伤睾丸和附睾形态结构，破坏血-睾屏障结构和功能，具有显著的雄性生殖毒性；血-睾屏障连接蛋白ZO-1、occludin、connexin-43和N-cadherin 的表达下调和MAPK信号途径的激活可