水稻小G蛋白Sar1介导蛋白质内质网转运的机理研究

Protein sorting and transport regulatory mechanism has made significant advances and become hotspot research now. COPII complex mediated protein transport from the endoplasmic reticulum to the Golgi apparatus. As a component of COPII, Sar1 plays a crucial role in initiating the COPII assembly on the ER, also involves in other regulatory processes such as cargo selection. Sar1 are encoded by multiple genes in plant, and function and regulation mechanism of each isoform is unclear. This study will focus on the function and specificity of 3 OsSar1 isoforms by cell biology and genetics methods. We will analyze the cellular expression and specific function of each isoform in vivo. The similarities and differences of each isoform function on the protein ER export will analyze by iTRAQ technology. The pull-down and yeast two-hybrid will be used to screen the OsSar1 interaction protein. This study will improve the plant COPII components function and its complexity, and elucidate the COPII regulation mechanism in protein transport.

蛋白质的分选和运输调控机制是生物学的热点研究领域之一。COPII复合体介导蛋白质从内质网向高尔基体的运输，其组分Sar1不仅负责启动运输小泡的组装，还参与货物蛋白分选等其他调控过程，在蛋白转运过程中发挥至关重要作用。植物中Sar1由多基因编码，各亚型的具体功能及调控机制尚不清楚。本项目重点研究三个水稻Sar1亚型的功能及其特异性，利用细胞生物学、遗传学等手段，从水稻生物体内和细胞水平分析各亚型的表达和功能特异性。同时提取内质网蛋白，借助iTRAQ技术，研究各亚型在介导内质网蛋白转运方面的异同。通过体内pull-down和酵母双杂交筛选OsSar1相互作用蛋白，以期找到植物中调控Sar1的新因子。本研究结果有利于深入阐明植物Sar1各亚型参与的蛋白转运复杂调控机制，完善植物COPII组分的功能及其复杂性、特异性，为植物中COPII介导的蛋白转运研究提供新的视角，具有重要理论意义。

蛋白质的分选和运输调控机制是目前生物学研究的热点之一。蛋白质从内质网向高尔基体的运输主要由COPII复合体介导，其组分Sar1不仅负责启动运输小泡的组装，还参与货物蛋白分选等其他调控过程，在蛋白转运过程中发挥至关重要作用。植物中Sar1由多基因编码，各亚型的具体功能及调控机制尚不清楚。水稻中有三个表达的编码Sar1的基因，分别命名为OsSar1A，OsSar1B和OsSar1C，组织表达定位表明三个基因在幼苗、根、茎、叶和种子中均有表达，但表达水平有明显差异。本项目重点关注三个Sar1亚型的功能及其特异性，亚细胞定位表明 OsSar1a，OsSar1b，OsSar1c在细胞内形成特异的点状结构可以与高尔基体和AtSec24共定位，分布于内质网运出位点，且三个亚型均在可溶性蛋白组分中表达相对较多，在膜组分中也有分布但相对较低，这一结果表明三个亚型均符合COPII复合体介导蛋白质从内质网向高尔基体运输的特性。通过RNAi干扰技术获得各个亚型特异表达降低的转基因株系，在各个生长时期和细胞水平进行表型观察，均未发现明显异常，表明Sar1的三个亚型间存在功能冗余。提取了水稻灌浆期种子的低水盐溶蛋白，通过iTRAQ方法对Sar1 RNAi的种子蛋白变化进行了系统分析，结果显示有405个蛋白的表达水平发生了2倍以上的变化，其中上调蛋白140种，主要参与蛋白修饰、蛋白转运和蛋白降解，下调蛋白265种，主要参与代谢途径与胁迫应答。进一步特异地提取水稻种子内质网蛋白，利用SWATH分析种子内质网胁迫的差异蛋白质组，差异表达蛋白有266个，其中上调蛋白105个，下调蛋白161个。KEGG代谢途径分析显示，光合生物的碳固定、碳代谢、内质网上蛋白加工、乙醛酸盐代谢和氨基酸的生物合成代谢途径在内质网胁迫情况下显著上调表达。本研究结果深入阐明植物Sar1各亚型的特异性和功能冗余性，为植物中COPII介导的蛋白转运研究提供新的视角，具有重要理论意义。同时研究了Sar1缺失引起的内质网胁迫机理，为后续研究奠定了基础。