小菜蛾Spatzle和Dorsal基因对抗菌肽表达调控的机理研究

昆虫抗菌肽是体内一种具有广谱抗菌作用的小分子多肽，其表达受Toll/NF-кB信号途径的调控。本项目拟以小菜蛾为实验材料，运用同源克隆结合RACE技术克隆小菜蛾Toll信号通路中的Spatzle(Spz)和Dorsal(Dor)基因，运用RNAi抑制Spz和Dor基因的表达，阻断或减弱小菜蛾抗菌肽产生的信号传导，使小菜蛾更易感染病菌而死亡，以期为通过调控害虫免疫系统的开启来控制害虫奠定基础；运用定量RT-PCR、Northern印迹等方法检测Spz及Dor阻断前后抗菌肽基因的表达谱，阐明Spz和Dor在小菜蛾免疫应答信号传导中的功能；采用SSH文库筛选免疫的健康小菜蛾和RNAi抑制小菜蛾虫体的抗菌肽cDNA序列，以期获得小菜蛾体内新的抗菌肽基因。该项目运用了靶标特异性强的RNAi技术，避免了环境污染，为小菜蛾的综合防治提供了一种新的手段，并为新的抗菌肽基因的筛选开辟新的思路。

1、.为了更好的挖掘小菜蛾体内的免疫相关基因，本项目测定了实验室敏感型小菜蛾和田间小菜蛾的转录组，综合筛选到725条与免疫相关的Unigene序列；其中Spatzle序列3条，Dorsal序列2条。 在此序列的基础上，利用RT-PCR和RACE克隆了小菜蛾Spatzle（KF960052）和Dorsal（KF960046）基因的cDNA全长和相关抗菌肽基因的cDNA全长，模式识别蛋白基因的cDNA全长，为研究Spatzle和Dorsal基因对抗菌肽的调控提供了靶标基因。.2、.为了更好探讨小菜蛾Spatzle(PxSpa)和Dorsal(PxDor)的结构和功能。在原核细胞中表达了Spatzle和Dorsal，并制备了多克隆抗血清。为了研究Spatzle的功能，在果蝇S2细胞中表达了Spatzle的功能区C-108个氨基酸（PxSpa-C108）和PxDor，利用His-taq一步纯化了重组的PxSpa-C108 和PxDor。利用制备的PxSpa-C108蛋白和抗PxSpa血清分别注射小菜蛾，结果表明在注射PxSpa-C108蛋白的血淋巴中的杀菌活性明显高于注射抗PxSpa血清的杀菌活性；同时注射PxSpa-C108蛋白的血淋巴中的细菌的存活率明显低于注射抗PxSpa血清的血淋巴中的细菌存活率；结果表明PxSpa在启动抗菌肽表达过程中起着重要作用；而注射PxDor蛋白并没有增强血淋巴的杀菌活性。.3、.利用RNAi阻断了PxSpa 的表达，荧光定量PRC检测表明，PxSpa 表达沉默后，PxDor基因的表达明显下降，抗菌肽基因Cecropin1，Cecropin2，Cecropin3，Gloverin，Defensin和Lysozyme1的表达明显降低，而且，RNAi阻断了PxSpa的表达后的血淋巴中的细菌M15存活率明显升高。RNAi阻断了PxDor的表达，也同样降低了以上抗菌肽的表达，结果表明PxSpa和PxDor在小菜蛾抗菌肽表达过程中起调控作用。进一步研究表明，PxSpa基因的沉默，提高了玫烟色棒束孢对小菜蛾的致病能力。.4、.通过以上研究，挖掘了小菜蛾免疫相关基因，明确了PxSpa和PxDor在小菜蛾抗菌肽表达中起着重要功能；发表文章4篇，其中SCI文章一篇；投稿文章（SCI）3篇；申请专利6个。