血管内皮生长因子A突变在先天性左室流出道梗阻畸形发生中的功能研究

之前研究发现血管内皮生长因子A（VEGFA）突变可引起遗传性心内膜垫缺损或瓣膜缺陷，VEGFA亚型敲除或表达降低的小鼠和斑马鱼其发生主动脉弓缺损的危险增加，提示VEGFA可能是先天性左室流出道梗阻（LVOTO，包括主动脉瓣狭窄、主动脉缩窄等）的致病基因之一，但具体功能并未明确。我们在前期LVOTO大样本筛查中发现了3种VEGFA突变(c.454C>T、c.998G>A和c.19_22dupGACA)，根据分子生物学理论分析推测上述突变可能影响VEGFA蛋白质结构和功能，故认为上述突变可能为致病性突变或致病因素之一。为明确VEGFA突变在LVOTO发生中的作用，我们将研究上述突变对RNA层面的影响，并通过构建突变体外表达分析、建立斑马鱼模式生物等方法，论证VEFGA突变可能致LVOTO的动物实验，探索VEFGA突变在LVOTO发生中的功能及作用。

先天性左室流出道梗阻（left ventricular outflow tract obstruction，LVOTO）是常见的先天性心脏病，包括从解剖左室流出道一直延伸到主动脉弓降部的一组狭窄性病变，涵盖了心室、瓣膜及大血管缺陷等多种临床缺陷，多种病变往往同时存在，提示在发育上可能受同一基因或信号通路调控。血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A ，VEGFA）是同时可以调控心脏和血管发育的重要基因，我们推测VEGFA可能与LVOTO有关。 前期大样本临床LVOTO患者VEGFA基因筛查发现了2种碱基变化（c.973C>T及c.998 G > A），但并未在正常对照组中发现上述突变，通过对VEGFA序列的分析论证其可能为致病性突变。为进一步研究VEGFA在心血管发育中的作用，我们以斑马鱼为模式动物，用morpholino对人VEGFA的斑马鱼同源基因vegfaa和vegfab进行敲低，结果发现，vegfaa 敲低胚胎存在心血管发育畸形，vegfab 敲低胚胎早期发育正常。我们进一步用类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease, TALEN)建立了稳定遗传的vegfaa斑马鱼突变体品系，vegfaa+/-可存活至成年，vegfaa-/-胚胎致死。研究发现，vegfaa促进血管动脉方向分化，其缺失导致动静脉分化障碍，体节间血管出芽缓慢紊乱，脑部背侧主动脉无法形成，表达flk的内皮细胞紊乱分布，所有血管管腔缺失。Vegfaa-/-心脏发育畸形，心室心房心肌细胞减少，不能发生内皮细胞间质化（Endothelial mesenchymal transition ，EMT），继而无法形成瓣膜。Vegfaa缺失使bmp4和Wnt-βcatenin在心脏过表达和异位表达。总之，我们研究发现vegfaa是调控心血管发育的重要基因，并与Bmp、wnt信号协同作用，调控心脏发育。本研究首次建立了斑马鱼稳定遗传的vegfaa突变品系，在体内水平证实vegfa具有调控心血管发育的作用。