光动力疗法对难治性皮肤溃疡中铜绿假单胞菌生物膜的影响及机制研究

The Pseudomonas Aeruginosa(PA) is one of the main pathogens for refractory skin ulcer. The biofilm formation caused by PA make skin ulcer chronic and difficult to treat in clinic. It have been proved photodynamic therapy (PDT) can inhibit the growth of planktonic PA and eliminate its biofilm in our previous study. In order to explore the effects and mechanisms of PDT for the structure and function of PA biofilm, several techniques are planned to be used in this project, including bacterial culture, morphology observation, RT-PCR, Westernblot, CLSM, Flow Cytometry, animal experiment and so on. The purposes of this project are to observe the effects of PDT to the structure,recurrence rate，expression of adhesion factors, virulence factors and antioxidant factors of PA biofilm in vitro and in vivo, and the effects of PDT to the healing of skin ulcer in vivo. Furthermore, the role of Quorum sensing (QS) system in PDT eliminating PA biofilm will be studied. This project is significant to demonstrate the mechanism of PDT eliminatting PA biofilm. It will provide further experimental evidences for PDT to treat refractory skin ulcer related to PA biofilm infection. It will be helpful to find a new breakthrough for the treatment of refractory focal infectious diseases.

铜绿假单胞菌是难治性皮肤溃疡的主要致病菌之一，生物膜的形成是其治疗困难的重要原因。我们前期研究已表明：光动力治疗能杀灭铜绿假单胞菌并清除其生物膜。为了进一步明确光动力对铜绿假单胞菌生物膜的结构和功能的影响及机制。本研究采用细菌培养、形态学观察、RT-PCR、Westernblot、激光共聚焦、流式细胞仪、动物实验等技术方法，观察光动力治疗对体外培养的和动物皮肤溃疡模型上的铜绿假单胞菌生物膜的结构，复发率，粘附因子、毒力因子、抗氧化因子等的表达的影响，以及在体对溃疡面愈合的影响，并进一步研究QS系统在光动力对铜绿假单胞菌生物膜作用中的地位及机制。以期阐明光动力对铜绿假单胞菌生物膜的清除作用及其机制，为光动力治疗用于铜绿假单胞菌生物膜相关性难治性皮肤溃疡提供进一步的实验依据，也为局灶性难治性感染性疾病的治疗寻找新的突破口。

皮肤溃疡时临床常见病，铜绿假单胞菌是其难治感染的主要致病菌之一，而生物膜的形成是其治疗的难点。光动力是杀灭微生物的新型方法之一。为了进一步明确光动力治疗对铜绿假单胞菌生物膜的结构和功能的影响，本研究采用细菌培养、形态学观察、RT-PCR、Westernblot、激光共聚焦、电镜、动物实验等技术方法，观察光动力治疗对体外培养的和动物皮肤溃疡模型上的铜绿假单胞菌生物膜的结构，粘附因子、毒力因子等的表达的影响，以及在体对溃疡面愈合的影响，并进一步研究QS系统在光动力对铜绿假单胞菌生物膜作用中的地位及机制。研究结果发现在体外实验中，光动力治疗能影响铜绿假单胞菌的结构，减少生物膜中活菌的密度，减少其粘附因子，毒力因子的表达，能抑制QS系统 (lasI, LasR, rhlI, rhlR，LasB 和phzH等)基因和蛋白表达。而在体实验也表明，光动力能促进铜绿假单胞菌生物膜感染的皮肤溃疡愈合，减少组织的含菌量，破坏生物膜结构，减少细菌粘附毒力因子的表达，抑制QS系统基因表达。