embAC与embB共突变对结核分枝杆菌乙胺丁醇药物敏感性的调节机制研究

The drug resistance of Mycobacterium tuberculosis (MTB) developed very quickly and bring a huge difficulties for the prevention and treatment of tuberculosis. Ethambutol (EMB) is an important first-line anti-TB drugs. It's well known that embB mutation leads to MTB resistant to EMB, but embB mutation still can't explain why the drug resistant level of the isolates with same embB mutant were quite different and why the embB mutation occurred in isolates susceptible to EMB. Our early study showed the mutation of embA or embC was detected in the isolates resistant to EMB and susceptible to EMB with embB mutations. Due to embA,embB and embC encoding arabinosyltransferase，this phenomena suggested embA and embC may be involved in regulating drug susceptibility to EMB in the MTB isolates with embB mutation. In this study, we aim to further analyze the effect of embA or embC mutation on the drug susceptibility to EMB, the expression of EmbABC, the enzyme activity of EmbABC and the structure of cell wall in the MTB strains with embB mutation. Implementation of this study will not only clarify the regulation mechanism of drug susceptibility to ethambutol of Mycobacterium tuberculosis by embA or embC in MTB strains with embB simultaneous mutation but also supply the clear target gene sites and evidences of genetic drug susceptibility testing to EMB in MTB strains.

结核分枝杆菌(MTB)抗药性发展非常迅速，为结核病的防治带来巨大困难。乙胺丁醇 (EMB)是重要的一线抗结核药物之一。已知embB突变可导致MTB对EMB耐药，但尚无法解释同样embB突变菌株EMB的药物敏感性存在巨大差异。本研究前期在embB突变的EMB敏感和耐药株中检测到embA或embC突变。embA、embC与embB共同编码阿拉伯糖基转移酶，embAC与embB共突变现象提示embA和embC基因可能参与调节embB突变的MTB菌株对EMB的药物敏感性。本研究将分析MTB中embA或者embC与embB共突变对EMB药物敏感性、EmbABC表达、EmABC酶活性及细胞壁渗透性的作用。该项目的实施将不仅阐明embA或者embC与embB共突变对EMB药物敏感性的调节机制，而且为基因药敏检测MTB的EMB药物敏感性提供更明确的检测位点和检测依据.

结核分枝杆菌(MTB)抗药性发展非常迅速，为结核病的防治带来巨大困难。乙胺丁醇 (EMB)是重要的一线抗结核药物之一。已知embB突变可导致MTB对EMB耐药，但尚无法解释同样embB突变菌株EMB的药物敏感性存在巨大差异。本研究前期发现在结核分枝杆菌临床分离株中embC-embA基因的间隔区域存在基因突变，embA、embC与embB共同编码阿拉伯糖基转移酶，embAC与embB共突变现象提示embA和embC基因可能参与调节embB突变的MTB菌株对EMB的药物敏感性。本研究进一步对767株结核分枝杆菌临床分离株的检测分析显示，embC-embA在275株乙胺丁醇耐药株中突变率为5.8%。相关系数分析显示embC-embA基因间隔区域突变与乙胺丁醇耐药具有相关性（r=0.3375，P<0.0001）。通过对不同embB, embC-embA突变型的临床分枝株embA和embB的mRNA检测显示，在embC-embA突变的分离株中，embA和embB的mRNA转录水平显著高于embC-embA野生型的分离株（p=0.0011，p=0.0003），提示embC-embA的突变可能调节embAB的转录。通过将不同突变型的embC-embA片段克隆入报告基因质粒载体pMC210的启动子区域中，检测报告基因的转录水平，结果显示embC-embA突变的片段作为启动子可以提高转录水平（p=0.0004）。为了进一步研究embC-embA突变导致转录水平提高的机制，本研究通过凝胶迁移试验检测，结果显示突变的embC-embA片段与embAB的转录调节子embR的结合力较野生型增强。同时，对所有临床分离株的乙胺丁醇MIC值的检测分析显示，同时具有embC-embA突变和embB突变的菌株，对乙胺丁醇的耐药水平显著高于仅embB突变菌株，此结果提示，embC-embA突变可提高已有embB突变菌株的乙胺丁醇耐药水平，同时也说明了同样embB突变菌株对乙胺丁醇耐药水平不同的原因。综上所述，embC-embA基因间隔区域突变通过增强与转录调节子的结合能力，提高embAB的转录，从而提高结核分枝杆菌对乙胺丁醇的耐药性，提示embC-embA可以作为一个新的分子标识用于结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药性的检测。本研究对767株结核分枝杆菌临床分离株的检测显示，以embB突变和embC-embA作为