穿心莲内酯衍生物AL-1调控TGFβ/Smad信号通路抗溃疡性结肠炎的作用机制研究

In 2014, the most popular targets for drug development had confirmed that TGFβ/Smad signaling pathway had become the key target for treatment of ulcerative colitis (UC), and NF-κB played an important role in the inflammation of UC. Andrographis extract HMPL-004 successfully obtained approval from the FDA of USA, which could be used for the Phase III clinical trials of UC. Therefore, on the basis of andrographolide (the active ingredient of andrographis), we synthesized and screened andrographolide-α-lipoic acid conjugates (AL-1) which had a significant role in the treatment of UC. Our results showed AL-1 could significantly inhibit the phosphorylation of p65 and IκBα. However, it has not been fully elucidated how TGFβ1/Smad and NF-κB signaling pathway is regulated in the treatment of UC. Therefore, according to the TGFβ1/Smad and NF-κB signaling pathway, we’ll reveal the molecular mechanism of AL-1 on treatment of UC from the molecular, cellular and animal level, and it will provide more adequate scientific evidences for the treatment of UC.

2014年药物研发最热门靶点证实，TGFβ/Smad信号通路已成为治疗溃疡性结肠炎(UC)的关键靶点，并且NF-κB通过对炎性介质的调控在UC炎症反应中起着关键作用。最新研究报道，穿心莲提取物HMPL-004成功获得美国FDA批准用于治疗UC的III期临床试验。本课题组以中药有效成分穿心莲内酯为母核进行结构修饰，合成并筛选出具有明显抗炎作用的穿心莲内酯-α-硫辛酸耦合物(AL-1)。前期研究证实AL-1对UC具有明显的治疗作用；进一步机制研究显示，AL-1可显著抑制p65和IκBα的磷酸化水平。但是，关于AL-1如何调控TGFβ1/Smad和NF-κB信号通路治疗UC的具体机制及NF-κB具体作用位点的研究尚未完全阐明。因此，本课题以TGFβ1/Smad和NF-κB信号通路为切入点，从分子、细胞和整体动物水平，进一步揭示AL-1改善UC的分子作用机理，为UC的有效防治提供科学依据。

本课题首先建立了TNBS诱导的小鼠结肠炎模型，研究了AL-1对结肠炎小鼠的保护作用，结果显示AL-1能够改善结肠炎小鼠的一般精神状态，逆转造模后小鼠体重的持续下降；降低结肠炎小鼠的DAI评分；改善结肠炎小鼠肠道的形态变化，增加结肠长度，减轻炎症；同时，AL-1能剂量依赖性改善小鼠结肠组织损伤，能够降低TNBS诱导小鼠结肠组织中MPO活性和血清中炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平，降低phospho-p65、phospho-IκBα、COX-2、p-ERK、p-JNK和p-p38蛋白的表达水平，升高PPAR-γ蛋白表达水平。进一步建立DSS诱导的UC小鼠模型，研究AL-1对溃疡性结肠炎的治疗作用。结果表明AL-1可有效地减轻小鼠结肠炎的症状，减轻血便，降低疾病活动指数，增加结肠长度，改善结肠组织病理学损伤情况，降低MPO活性，减少炎性细胞浸润。机制研究表明，AL-1通过抑制MAPK和NF-κB信号通路的激活，减少促炎细胞因子的生成，同时增加抗炎细胞因子的释放，发挥抗炎活性而对UC小鼠产生治疗作用。研究了AL-1对DSS诱导小鼠结肠炎黏膜的保护作用。实验结果表明，AL-1可显著降低DSS诱导而导致的小鼠肠道通透性的增加；可显著保护结肠炎小鼠结肠黏膜的完整性；可减少紧密连接蛋白降解，从而显著降低小鼠结肠炎肠道通透性增加，恢复肠道正常通透性水平。机制研究表明，AL-1可呈剂量依赖性地明显减少pMLC2和MLCK在结肠炎小鼠结肠中的表达量；可通过抑制MLCK/MLC2通路蛋白表达维持小鼠结肠上皮紧密连接的完整性。最后，我们建立了经典的LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型来评估AL-1的体外抗炎能力及探讨机理。结果表明，AL-1能够明显改善细胞活力，抑制TNF-α、PGE2、IL-1β和IL-6的产生。此外，AL-1能够抑制胞浆NF-κB向胞核转移，降低细胞iNOS、TNF-α、PGE2、IL-1β和IL-6的mRNA水平以及p38、ERK、JNK、p65、IκBα的磷酸化水平，产生强大的抗炎作用。机制研究表明，AL-1主要是通过抑制细胞内MAPK和NF-κB信号通路的激活，减少炎症细胞因子的产生，从而对RAW264.7细胞发挥抗炎保护作用。总之，通过本课题的系统研究，阐明了AL-1对溃疡性结肠炎的保护作用及机理，为溃疡性结肠炎的有效防治提供了理论依据。