GABAB受体对不同G蛋白亚型的动态激活机制研究

GABAB receptor is the metabotropic receptor of gamma-aminobutyric acid (GABA), the main inhibitory neurotransmitter in the central nervous system (CNS) and also is a member of G protein coupled receptor family (GPCR) group C. It is involved in multipal functions in CNS and is a very important drug target. The concept of ligand biased signaling has classified receptor function and asked for highly sensitive pharmacological assays to fully capture the nuances of ligand activity. Directly exploring the initial step of GABABR activation of heterotrimeric G proteins avoid the complexity of downstream signaling pathway and regulation events. So in this project, we propose to use BRET technique to study the mechanism of GABABR-activated G protein, especially different Galpha protein subfamily. The project includes: identify the key domain of GB1 and GB2 subunit interact with Galpha, Gbeta/gamma, detect the dynamic interaction change between Galpha and Gbeta/gamma following GABABR activation, finally investigate the roles of different Galpha subfamily in GABABR-mediated downstream pathway. This research will clarify the dynamic signal transfer directly from receptor to G protein and provide evidence for biased ligand screening based on different G protein subfamily and also the potential role in GABABR function modulation.

GABAB受体（GABABR）是中枢神经系统中主要的抑制型神经递质GABA的代谢型受体，也属于G蛋白偶联受体家族C组成员之一。它参与调节了多种神经系统生理功能，是重要的药物靶点。偏向性配体的概念细化了受体的激活效应，并期望有更灵敏的检测手段衡量受体激活的细微变化。直接对受体激活起始阶段，即受体激活G蛋白三聚体机制的研究避免了下游信号通路研究的复杂性。因而，在本项目中，我们期望利用BRET技术研究GABABR对Ga蛋白尤其是其不同亚型的激活机制，包括鉴定GABABR不同亚基与Ga，Gbg相互作用的重要结构域，测试受体激活过程中，不同的Ga亚型与Gbg相互作用变化的差异，最后检测不同Ga亚型对GABABR介导的下游信号通路的影响。本研究将阐明GABABR激活信号从受体到G蛋白的传导过程，为建立基于不同G蛋白亚型的偏向性配体筛选模型提供理论基础，并为揭示不同偏向性配体的潜在功能提供实验依据。

GABABR是中枢神经系统中主要的抑制型神经递质GABA的代谢型受体，也属于G 蛋白偶联受体家族C 组成员之一。它参与调节了多种神经系统生理功能，是重要的药物靶点。在本项目中，我们利用生物发光共振能量转移（BRET）技术对GABABR激活的Ga蛋白不同亚型和机制进行了研究，并取得了如下创新性发现：1）筛选了GABABR激活的不同G蛋白亚型进行了筛选，发现了GABABR可以激活G13蛋白；2）检测了GABABR-G13介导的非Gi/o蛋白依赖新型JNK信号通路，并初步检测到GABABR参与调节了神经突触的分支数目；3）比较了GABABR两个亚型GABAB1a和GABAB1b对下游G蛋白激活的药理学曲线，发现两者在Gi1激活EC50上存在差异，在GoA和GoB最大激活强度上GABAB1b>GABAB1a，而在Gi2和Gi3激活上差异不明显；4）通过优化BRET手段，我们对皮层神经元和海马神经元中内源性表达的GABABR激活的下游G蛋白亚型进行了分析，发现了不同神经元中内源性表达的GABABR差异性激活不同G蛋白亚型。与过表达GABABR的HEK细胞中得到的结论不同，GABABR不能激活海马神经元中Gi3，而在皮层神经元中不能激活GoB。本项目工作一方面建立并优化了基于蛋白质-蛋白质相互作用检测G蛋白激活的BRET技术，为国内GPCR功能领域检测提供了新的检测平台；另一方面在信号机制研究中，发现了GABAR调节的新蛋白G13，以及神经元中内源性GABABR的组织差异性信号通路，为GABABR偏向性信号研究提供了新的思路。