慢病毒载体介导RNA干扰抑制Livin基因表达增强大肠癌细胞化放疗敏感性的研究

Livin能够强烈抑制细胞凋亡，并与肿瘤细胞对化疗药物耐药有关。我们前期研究发现Livin在Dukes'B期大肠癌细胞中表达上调，并与患者较短的无病生存期和总生存期有关；我们还发现耐奥沙利铂的结肠癌细胞系Livin基因表达明显上调；利用化学合成的siRNA分子在体外试验中有效地抑制了大肠癌细胞系HT-29细胞中Livin基因的表达，并发现Livin抑制后细胞凋亡率明显增加，细胞阻滞于G1期。本项目在此研究基础上，首先构建Livin基因RNA干扰慢病毒载体，然后转导至大肠癌细胞系，在mRNA和蛋白质水平观察对Livin基因的抑制，并绘制生长曲线，并观察细胞周期、凋亡率、克隆形成能力及侵袭力的变化，MTT法检测与大肠癌常用化疗药物及放射线是否具有协同杀瘤作用，并检测凋亡信号传导通路中部分分子活性的变化；将RNA干扰慢病毒载体转导至荷瘤裸鼠瘤体内，观察其与化放疗联合对肿瘤生长的抑制作用。

Livin为凋亡抑制蛋白家族成员（IAP）之一，特异性表达于人的胚胎组织、胎盘组织以及大多数恶性肿瘤细胞，并能抗死亡受体、线粒体及化疗药物介导的凋亡作用，与多种肿瘤的发生、发展和预后相关。前期研究我们发现Livin在Dukes’B期结直肠癌组织中高表达，并且其表达与肿瘤复发和/或转移、总生存不佳有关。在此基础上，采用慢病毒载体介导的RNA干扰抑制人结肠癌细胞HT-29 Livin基因表达，分别通过体外和体内试验探讨HT-29细胞生物学行为的改变及其对放、化疗敏感性的变化。通过体外试验我们发现：成功构建3对靶向Livin基因的重组慢病毒Livin-RNAi-LV；通过半定量RT-PCR、荧光实时定量PCR和western blot技术检测重组慢病毒感染HT-29细胞后Livin mRNA和蛋白的表达，筛选获得干扰效果最佳之Livin-RNAi-LV1#进入后续试验；重组慢病毒Livin-RNAi-LV1#感染HT-29后，台盼蓝拒染法显示细胞生长明显减慢，与对照相比有统计学差异；克隆形成实验显示感染后的HT-29细胞克隆形成能力明显减弱，克隆形成率为17.33%，；TUNEL法显示细胞凋亡指数AI达到26.02%，高于对照组的2.67%（P<0.01）；流式细胞术检测显示Livin基因沉默后细胞凋亡率38.43%，并且细胞周期重新分布，G0/Gl期升高，S期细胞比例降低，G2/M期降低；Matrigel穿膜侵袭实验显示细胞体外侵袭能力减弱，穿膜细胞数减少；Livin基因抑制后细胞caspase-3活性明显增加；Caspase-9的活性无明显变化。Livin-RNAi-LV1#能增强HT-29细胞对5-FU、Oxaliplatin和CPT-11的敏感性，增敏倍数分别为1.63、1.74和2.24。通过体内试验我们发现：成功构建皮下移植瘤裸鼠模型，实验组移植瘤体积及瘤重明显低于阴性对照组和空白对照组；TUNEL法发现实验组瘤组织细胞凋亡率明显升高；Livin基因RNA干扰慢病毒载体系统能增强伊立替康的抗肿瘤作用，移植瘤体积明显小于对照组，裸鼠生存时间延长；Livin基因RNA干扰慢病毒载体系统联合总量为10Gy的6MV 放射线时，发现实验组移植瘤体积明显小于对照组，提示Livin基因RNA干扰慢病毒载体系统和放射治疗具有协同作用。