熊果酸通过调节MMP/TIMP失衡诱导小胶质细胞向M2表型转化介导脑缺血再灌注损伤中神经元保护作用的分子机制

Microglia activation has different polarization phenotypes and dual effects, and the induction of microglia transformation from M1 phenotype to M2 phenotype is the key to neuroprotection in cerebral ischemia-reperfusion injury after acute cerebral infarction recanalization therapy. In precious studies, we found that ursolic acid can down-regulate M1 phenotypic markers in MCAO/R rats brain and up-regulate M2 phenotypic markers through activating PPARγ, thereby reducing MMP/TIMP imbalance and exerting neuroprotective effects. Bioinformatics predicted that PPARγ bound with MMP-9 and TIMP-1 promoters, suggesting that ursolic acid can reduce MMP/TIMP imbalance through PPARγ， and induce microglial M2 polarization. However, it still needs to be further studied. Based on the key PPAR response element confirmation of PPARγ bound with MMP-9 and TIMP-1 promoters, this project elucidated the molecular mechanism of ursolic acid promoted microglial M2 polarization and reduce MMP/TIMP imbalance via PPARγ activation. Furthermore, we also will establish a microglia/neuron co-culture system to verify the neuronal beneficial effects of ursolic acid mediated by inducing microglial M2 polarization. This study is expected to provide a new ideas for ursolic acid to be an effective treatment, and find novel targets for acute cerebral infarction therapy.

小胶质细胞激活具有不同的极化表型和双重作用，诱导小胶质细胞由M1表型向M2表型转化是急性脑梗死再通治疗后抗脑缺血再灌注损伤的关键切入点。申请者发现：熊果酸可以通过激活PPARγ下调MCAO/R大鼠脑内M1表型标志物、上调M2表型标志物，由此纠正MMP/TIMP失衡，发挥神经保护作用。信息学预测PPARγ可与MMP-9及TIMP-1启动子结合，提示熊果酸可能是通过PPARγ调节MMP/TIMP失衡，诱导小胶质细胞向M2表型转化，但尚需研究证实。本项目在确认PPARγ与MMP-9及TIMP-1启动子结合关键位点的基础上，阐明熊果酸诱导小胶质细胞向M2表型转化的药理作用和分子机制，进一步明确熊果酸能改善脑缺血再灌注中神经元损伤。本研究有望为熊果酸成为有效的脑梗死急性期治疗药物提供新的理论基础，为调控小胶质细胞极化从而影响神经免疫微环境成为急性脑梗死治疗的切入点提供新的实验依据。

小胶质细胞激活具有不同的极化表型和双重作用，诱导小胶质细胞由M1表型向M2表型转化是急性脑梗死再通治疗后脑缺血再灌注损伤中神经元保护作用的关键切入点。申请者发现：熊果酸可以下调MCAO/R大鼠脑内M1表型标志物、上调M2表型标志物，由此纠正MMP/TIMP失衡，发挥神经保护作用。信息学预测PPARγ可与MMP-9及TIMP-1启动子结合调控其表达，提示熊果酸通过PPARγ诱导MG-M2表型转化并调节MMP/TIMP失衡，但尚需研究证实。本课题组通过细胞实验证实，UA可诱导BV-2细胞发生MG-M2表型转化，同时培养液中MMP-9水平降低，TIMP-1水平升高。使用PPARγ特异性选择性抑制剂处理BV-2细胞后，UA调节MMP/TIMP失衡调节减弱。但构建的MMP-9启动子区与TIMP-1启动子区质粒分别转入PPARγ过表达的HEK293T细胞中，发现二者的启动子活性都比较弱，过表达转录因子PPARγ后，启动子活性稍有增加或者没增加。接下来构建MMP-2启动子全长质粒，与PPARγ质粒共转至HEK293T细胞中，发现PPARγ对MMP-2启动子转录活性有调节作用。进一步构建MMP-2启动子区质粒分别与PPARγ质粒共转染至HEK293T细胞；比较分析不同PPRE对PPARγ调控MMP-2转录活性的影响，确认了参与PPARγ调控MMP-2转录活性的PPRE4是导致MMP-2减少的最重要的PPRE。这些结果表明，UA通过改变PPARγ与MMP-2启动子中PPRE位点的结合，促进小胶质细胞向M2表型方向的小胶质细胞极化。本项目在确认PPARγ调控MMP-9及TIMP-1表达关键位点基础上，阐明熊果酸诱导MG-M2表型转化的分子机制，明确熊果酸诱导MG-M2表型转化并通过PPARγ调节MMP/TIMP失衡、进而改善脑缺血再灌注中炎症反应介导神经元保护作用。本研究表明，UA在缺血/再灌注损伤模型中，通过稳定MMP/TIMP失衡来抑制小胶质细胞诱导的神经元细胞死亡，并且可能通过PPARγ激活抑制神经炎症损伤从而表现出神经保护作用，PPARγ可特异性结合炎症因子启动子，选择性地调节小胶质细胞极化，减少炎症介质和细胞因子的产生，为熊果酸成有效的脑梗死急性期治疗药物提供新的理论与实验依据。