葫芦科作物基因功能验证平台技术VIGS体系的创建

The sequencing of genome of watermelon, muskmelon, cucumber , a large of sequences of resistance genes to disease, resistance to stress and other related expressed sequence tags(ESTs) lay foundation of screening of genes and study of gene function of cucurbit crops. Virus inducing gene silencing (VIGS ) is one of powerful tools of gene function research in crops, and VIGS for cucurbits are urgently needed to be explored. Cucumber green mottle mosaic virus(CGMMV) can infect several cucurbitaceous crops, the size of the CGMMV genome is only 6.4Kb, it is easy to construct the mutant at DNA level, it is very suitable for the VIGS vector construction ,. Based on the infectious clone of CGMMV, the PDS and are used to construct the VIGS vector in cucurbitaceous crop. Subsequently, to further verify the universality and currency of VIGS, the CH42 gene is studied in the project. The implementation of the project will provide a fast, efficient, high-throughput platform technology of the gene function research of the cucurbitaceous crops and accelerate the functional genomics research of cucurbit crops and promote the sustainable development of industry of cucurbit crops .

西瓜、甜瓜和黄瓜等葫芦科作物基因组测序的完成，积累了抗病、抗逆等相关表达序列标签，奠定了葫芦科作物优异基因挖掘及基因功能研究的基础。病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术是基因功能验证平台技术，目前亟需研究葫芦科作物的VIGS技术。黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)寄主范围广，能系统侵染多种葫芦科作物，且基因组只有6.4Kb，易于在DNA水平进行基因重组。本研究在病毒侵染性克隆成功构建的基础上，以八氢番茄红素脱氢酶PDS基因为指示基因，以CGMMV为病毒载体，通过点突变和DNA重组等技术，创制葫芦科作物基因验证功能研究的VIGS体系。随后用西瓜、黄瓜和甜瓜上参与叶绿体发育的核基因CH42验证该VIGS载体的广泛性和适用性。该项目成果为在葫芦科作物上利用VIGS研究其基因功能提供快速、高效、高通量的平台技术，加快葫芦科作物功能基因组学的研究，促进我国葫芦科作物产业可持续发展。

葫芦科作物是我国重要的水果和蔬菜，新品种的培育需要挖掘重要农艺性状的基因。黄瓜、西瓜和甜瓜等多种葫芦科作物基因组已被测序，这为优异基因的挖掘及其功能研究奠定了基础。葫芦科作物的遗传转化耗时费力且转化效率极低，病毒诱导的基因沉默（Virus-induced gene silencing, VIGS）技术为葫芦科作物功能基因组学的研究提供了便利。本研究选择在自然条件下可侵染葫芦科作物的黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus, CGMMV）为材料，采用该病毒的侵染性克隆，首先摸索外源基因片段插入的位点、其次鉴定外壳蛋白（Coat Protein, CP）亚基因组启动子（Subgenomic Promoter, SGP），再分析沉默效应，从而构建了可用于研究葫芦科植物基因功能的VIGS 载体。本文主要的研究结果如下：.（1）明确了插入位点在 CGMMV CP 基因终止密码子与3' 非编码区之间，不适合用于构建VIGS 载体。.（2）鉴定了 CGMMV CP 的亚基因组启动子SGP。.（3）构建了包含重复190 bp的 CGMMV CP 亚基因组启动子和一个单限制性酶切位点BamHI 的VIGS载体：CGMMV-BamHI。.基于 CGMMV CP 亚基因组启动子鉴定的信息，确定了构建 CGMMV VIGS 载体的合适的插入位点，并证实了插入片段在 100 bp~300 bp 均可诱导葫芦科作物相关基因（PDS）的沉默，插入片段为 69 bp 的发夹结构时，接种植物出现光漂白表型时间较早，沉默效率介于插入片段为150 bp 与 213 bp 的载体之间。.本文明确了采用 CGMMV 病毒构建 VIGS 载体时外源基因片段的插入位点，鉴定了CGMMV 亚基因组启动子，成功构建了基于 VIGS 载体，该载体具有引发症状轻微、沉默效率高等特点，为研究葫芦科作物基因功能提供了平台技术，必将有力促进葫芦科作物相关优异基因的挖掘与鉴定。