以肠道菌群为靶点的老鹳草素调控TMAO生成及抗动脉粥样硬化的机制研究

Macrophage inflammatory state and lipid metabolism disorder are the main course of atherosclerosis. Some studies showed that trimethylamine-N-oxide (TMAO) is related to macrophage bubblization, however, the relationship between TMAO and macrophage inflammation is still unknown. Our previous studies have shown that TMAO can promote macrophage inflammation. TMAO acts as a bridge between macrophage inflammation and macrophage lipid metabolism, and thus regulating it can be a effective way to manage macrophage inflammation and macrophage lipid metabolism. Our previous studies also found that geraniin could effect the level of TMAO in plasma, and TMAO is generated from gut microbiota. We propose a hypothesis that geraniin regulating trimethylamine-N-oxide production and exerting anti-atherosclerotic effect through targeting gut microbiota. This project will clarify geraniin’s effect on gut microbiota through ApoE-/- mouse model, uncover geraniin regulating TMAO metabolic transformation through gut microbiota and getting plaque regression, discuss the mechanism of TMAO’s effect on macrophage inflammation and macrophage lipid metabolism. To sum up, our project will provide new anti-atherosclerotic targets and new thinkings.

巨噬细胞炎症和脂质代谢紊乱是动脉粥样硬化（Atherosclerosis, AS）的重要机制。研究提示氧化三甲胺（Trimethylamine-N-oxide, TMAO）与巨噬细胞泡沫化相关，但与巨噬细胞炎症的关系尚不明确。本项目预实验发现TMAO存在潜在的促进巨噬细胞炎症活性，故TMAO成为联系巨噬细胞炎症和脂质代谢的重要桥梁分子，调控TMAO的水平即可以有效干预巨噬细胞炎症和脂质代谢。我们前期研究发现老鹳草素可以影响血中TMAO水平，而TMAO的生成有赖于肠道菌群，因此我们首次提出假说：老鹳草素以肠道菌群为靶点影响TMAO生成进而发挥抗AS的作用。本项目拟在ApoE-/-小鼠AS模型中明确老鹳草素对肠道菌群组成的影响，揭示老鹳草素通过肠道菌群调控TMAO代谢转化进而逆转AS斑块，体外实验探讨TMAO对巨噬细胞炎症及脂质代谢的作用及作用机制。本项目为抗AS提供新的靶点和研究思路。

在巨噬细胞炎症和脂质代谢紊乱是动脉粥样硬化（Atherosclerosis, AS）的重要机制。研究提示氧化三甲胺（Trimethylamine-N-oxide, TMAO）与巨噬细胞泡沫化及炎症的相关。多酚类化合物有潜在的调控肠道菌群活性，老鹳草素是一种化学结构及药理活性良好的多酚类化合物，是否能调控肠道菌群尚不清楚。通过C57BL/6J ApoE-/-小鼠分为5组（每组8只），饲喂普通饲料（Chow组，0.08%胆碱饲料；Cho组，1%胆碱饲料；Cho + Ge组，1%胆碱饲料和80mg/（kg·d）老鹳草素；Cho + Ab组，1%胆碱饮食和10mg/（kg·d）万古霉素，50mg/（kg·d）利福昔明；Cho + Ge + Ab组。12周后LC/MS法检测其TMA及TMAO水平，并对其结肠内容物进行16S rDNA菌群测序，小鼠主动脉横截面及纵切面进行苏丹IV染色、油红O染色及免疫荧光染色，评价AS斑块的大小。ELISA法检测血浆IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α水平。体外培养RAW264.7细胞，利用 oxLDL刺激，并以不同浓度TMAO处理，TMT定量蛋白质组学筛选关键功能蛋白。在本研究中，小鼠经老鹳草素干预后，血浆TMAO水平明显降低。Cho + Ge处理的小鼠菌群以拟杆菌门（65.3%）和厚壁菌门（30.6%）为主，与Chow组基本相同。苏丹IV染色和油红O染色表明，与普通饲料喂养相比，胆碱喂养表现出更严重的AS特征，包括更大的AS斑块面积和胆固醇含量。然而，使用老鹳草素可显著减轻这种影响。与普通饮食组相比，胆碱饮食组小鼠具有更多的M1型巨噬细胞（F4/80+CD16/32+细胞）。同样，给予老鹳草素或抗生素处理也能显著减轻这种影响。胆碱饮食组小鼠血浆IL-1β、IL-6、TNF-α水平明显升高，IL-10水平明显降低；老鹳草素处理后以上促炎性炎症因子水平显著降低，IL-10水平则显著升高。TMT 定量蛋白质组学检测，TMAO组与对照组相比，差异表达蛋白质上调以及下调的数量分别为203个、139个。本研究初步明确了老鹳草素能够重塑肠道菌群，逆转因胆碱饮食引起的优势菌群的比例失调，降低肠道菌群依赖的TMAO的生成，而TMAO可以影响噬细胞的炎症反应及脂质代谢，从而发挥抗AS的作用，这些结果为老鹳草素潜在的心血管保护作用开辟了一条新的研究途径。