人感染H7N9禽流感病毒致病和天然免疫应答机制的研究

Influenza A viruses are major cause of respiratory disease in humans.It is known that influenza pandemics arise from genetic reassortment between avian and human influenza viruses or alternatively by the direct adaptation of a avian influenza viruses to efficient human-to-human transmission. A novel reassortant avian-origin influenza A (H7N9) virus associated with severe and fatal respiratory disease in human has been identified in Shanghai, but the basis for their virulence remains unclear. Studies in other avian-origin influenza A virus (subtype H5N1) have suggested that high and disseminated viral replication is important for disease pathogenesis and virus-induced cytokine dysregulation (cytokine storm) may contribute to disease severity. Moreover, influenza virus is found to evolve multiple mechanisms to attenuate the type I IFN response, which plays a major role in defense against influenza virus infection, allowing successful replication in the host cells. Thus, it is worthy to further study whether the severe and fatal respiratory disease caused by H7N9 is relevant to IFN antagonist and dysregulated cytokine production. In this study, we will investigate the cytokine profile induced by H7N9 infection in human alveolar epithelial cells as well as macrophages cells, and assess the relevance of cytokine production and the severity of the disease. Meanwhile, the mode and mechanisms of H7N9 influenza A virus and its NS1 protein to antagonise the pathogen recognition receptor RIG-I and the type I IFN system will be studied. This work will be helpful to reveal the mechanisms of pathogenesis of H7N9 infection and related innate immune responses, provide solid basis for developing new drugs, as well as providing a theoretical basis to optimize clinical treatment programs.

2013年3月，一种新型禽流感病毒（H7N9）在上海被发现，部分患者临床表现为重症肺炎，严重者进一步发展为急性呼吸窘迫症而死亡，但尚不清楚引起严重肺部炎性损伤的机制。以往研究显示，流感病毒一方面能够拮抗干扰素系统，另一方面可诱导大量炎症细胞因子的产生。H7N9感染人体引起严重临床症状及较高的病死率，是否也与其在肺泡上皮细胞及巨噬细胞中大量增殖，诱导免疫细胞的大量聚集，并通过拮抗干扰素系统，促使病毒进一步复制、激活大量细胞因子的产生等相关，值得深入研究。本课题将在体外实验中研究H7N9感染肺泡上皮细胞及巨噬细胞后细胞因子产生情况及可能机制，探讨疾病的严重性是否和大量细胞因子的产生相关；并同时研究H7N9及其NS1蛋白拮抗IFN系统的模式及可能的分子机制，探讨干扰素拮抗与病毒复制增强和致病的关系。本研究将有助于揭示H7N9的致病机制并为寻找新的药物靶点、优化临床治疗方案提供理论依据。

2013年3月，中国先后报道并确诊了多例H7N9禽流感病毒感染人造成重症肺炎甚至死亡的疫情。为明确H7N9病毒感染引发严重肺部炎性损伤的机制，本课题针对H7N9感染后肺泡上皮细胞及巨噬细胞内细胞因子的产生情况、H7N9拮抗干扰素系统的情况及H7N9临床耐药变异毒株的生物学特性开展了研究。.对H7N9感染患者血清细胞因子谱的研究显示，IP-10、IL-6等细胞因子的表达水平在H7N9感染患者中显著高于正常人、在重症组患者中显著高于轻症组患者，这提示IP-10与IL-6与H7N9的致病相关；同时，患者血清中细胞因子的水平与同期咽拭子及血清中的病毒载量具有明显的相关性。在体外细胞感染模型中，H7N9也可明显诱导大量细胞因子。以上结果表明，H7N9感染后细胞因子的大量产生与疾病预后相关，并与病毒的复制直接相关。.对H7N9病毒及其NS1蛋白拮抗IFN系统的模式研究表明，H7N9 NS1蛋白抑制干扰素诱生的能力正常，但其抑制干扰素信号通路的能力较弱；H7N9 NS1与CPSF30结合的关键位点也存在着变异。同时，病毒感染实验也显示，H7N9感染可以高水平地诱生I型干扰素及ISGs的表达。但尽管诱生了大量的IFN和ISGs，H7N9仍可以进行有效的复制，即高细胞因子水平与高病毒载量的状态共存。这提示H7N9感染中诱生的大量IFN和ISGs可能更多地参与了炎性致病的过程。 .本课题组在前期临床接受达菲治疗的病例中发现，病毒持续复制和不良预后与体内H7N9病毒发生NA-R292K突变相关。我们从有明确耐药表型的临床病例标本中直接分离到292K耐药毒株（AH1 lineage），此耐药毒株体外病毒复制能力与野毒株相似，而在体内的致病力弱于野毒株，这可能与292K突变引起NA活性降低有关。尽管耐药毒株对奥司他韦和帕拉米韦等NAI药物有耐药性，但对扎纳米韦和non-NAI类药物有敏感性，提示静脉注射扎纳米韦或使用non-NAI类药物可作为临床奥司他韦耐药病人的替代治疗方案。.本研究提示H7N9感染人体可引起严重的临床症状及较高的病死率，与其拮抗干扰素系统、在肺泡上皮细胞及巨噬细胞中大量增殖，诱导免疫细胞的大量聚集，激活大量细胞因子产生相关。此外，H7N9耐药突变株的出现提示应继续加强对H7N9禽流感病毒的监测。本研究有助于揭示H7N9的致病机制并寻找新的药物靶点，为优化临床治疗提供依据。