Microbulbifer属的对羟基苯甲酸合成代谢及调控研究

p-Hydroxybenzoate (pHBA) is an important chemical compound used for synthesis of liquid crystal. Production of pHBA from renewable resources is an effective mean to solve social problems such as environmental pollution and petroleum exhaustion. The structure of pHBA is similar to aromatic amino acids, it is possible to biosynthesize pHBA from renewable resources using microbial aromatic amino acids synthesis pathway, shikimate pathway. I have isolated a marine bacterium, Microbulbifer, and found it accumulated pHBA and pHBA alkyl ethers when culturing it with glucose. Glucose is a renewable resource, which could be made from biomass resources, such as woods, grasses, waste paper and so on. This fingding was the first time in the world and I got a patent in Japan. Based on my preceeding study, our plans in this proposal are: (1) using isotope labeling method or other means to identify pHBA synthesis pathway in Microbulbifer and compairing it with others; (2) cloning of key gene(s) for synthesis of pHBA by using degenarated primers and construction of mutants; (3) elucidation mechanisms for key gene(s) regulation in pHBA synthesis of Microbulbifer. This study will be a fundamental research for synthesis of pHBA using Microbulbifer from renewable resources.

对羟基苯甲酸(pHBA)是一个可用于生产液晶等用途广泛的有机原料，利用可再生资源取代石化资源合成pHBA可避开环境污染和资源枯竭等社会问题。pHBA的化学结构类似于芳香族氨基酸，理论上利用微生物的芳香族氨基酸合成途径，即莽草酸途径可以生物合成pHBA。项目申请者从海洋环境中分离出一株属于Microbulbife的菌株，发现它具有将可再生资源的葡萄糖降解转化为pHBA和pHBA酯类的功能。这项成果为世界首例，在这个前期工作基础上本项目的研究目标设为：（1）解明Microbulbifer的pHBA合成途径，分析它的莽草酸途径与其他菌株的异同点；（2）设计简并引物或构建突变株等方法克隆合成途径上的关键基因；（3）利用生化生理等实验和表达量的研究阐明关键合成基因的调控机制。这些研究目标达到后我们可以掌握Microbulbifer的pHBA合成及调控机制，为今后的应用开发提供基因和信息方面的资源。

【背景】海洋细菌Microbulbifer sp. A4B-17菌株有合成对羟基苯甲酸（4-hydroxybenzoic acid, 4HBA）和其酯类等次级代谢产物的功能。4HBA是用途广泛的有机合成原料，4HBA酯类有抑菌作用，作为防腐剂广泛应用于食品和化妆品的保存上。利用可再生资源取代石化资源生物合成4HBA可避开环境污染和资源枯竭等社会问题。本项目的研究目标是：（1）阐明A4B-17菌株合成4HBA的机制；（2）构建高效4HBA合成的工业微生物。.【结果】（1）A4B-17菌株的生理生化特征。A4B-17菌株在MB培养基中的生长速度较快，大约10小时到达稳定期。有些海洋微生物在实验室里很难达到高浓度培养，而A4B-17菌株是一个容易培养的菌株，在短时间内达到较高的浓度，这对于今后开发成工业微生物是一个优点。A4B-17菌株在25℃-40℃的范围都可以生长，最适生长温度是35℃。最适盐浓度是22.8 g/L。（2）从唯一碳源合成4HBA。ONR7a是海水的无机盐基础培养基，当加入葡萄糖或果糖作为唯一碳源时，A4B-17菌株也能良好生长。而且在含有指示菌株的平皿上形成抑菌圈。这个实验说明A4B-17菌株可以从葡萄糖或果糖出发合成4HBA和酯类化合物。（3）基因组测序。为了迅速阐明4HBA的合成途径和基因，我们对A4B-17菌株的基因组进行了测序和注释。基因组全长为5,040,512 bp、GC含量为48.73%、预测出4766个基因。（4）基因组分析。4HBA的生物合成涉及三个代谢途径：葡萄糖至烯醇式丙酮酸的葡萄糖代谢途径；葡萄糖至4-磷酸赤藓糖的磷酸戊糖途径；合成分枝酸的莽草酸途径。在基因组信息中我们找出了这些途径的所有基因。从分枝酸到4HBA的反应是由一个分枝酸裂解酶催化，编码这个酶的基因在基因组中有一个GL000722。GL000722与研究比较深入的大肠杆菌的UbiC几乎没有相似性，而和一些没有研究的基因相似性很高。.【意义及后续研究】本项目首先研究了A4B-17菌株的生理生化特征，并证明从唯一碳源的葡萄糖或果糖可以合成4HBA。我们成功测序和注释了A4B-17菌株的全基因组，并找出了相关4HBA合成途径上的基因。这些研究对于今后的构建高效4HBA生产工业菌株奠定了基础。后续研究计划：（1）基因敲除验证预测基因的功能；（2）4HBA和酯类的调控机制。