人参皂苷单体Rb2抗瘟病毒作用机制研究

Infections of livestock (cattle, pigs and sheep) by members of Pestivirus genus(Flaviviridae family) produce heavy economic losses worldwide and availability of effective and inexpensive anti-pestiviruses agents is strongly needed. Bovine viral diarrhea virus (BVDV) is the prototype of the genus, in addition to its intrinsic importance as an economic burden to the farming industry. it is also used as a surrogate for hepatitis C virus (HCV) for the identification and development of new anti-HCV agents. In the previous work, we found that the ginsenoside-Rb2 inhibits BVDV and CSFV infection. In the study, we would study on the mechanism of action of the pestivirus antiviral compound ginsenoside-Rb2 in virus life cycle, especially in the early steps of BVDV infection.The cell-binding assays, luciferase reporter assay , immunofluorescence assay, Real-time RT-PCR, RNAi and IPA would be used in this study. Further more, the effect of ginsenoside-Rb2 on the genes associated with virus replication in the cells infected with pestivirus would be studied. These results will provide new insights into the antiviral mechanism of ginsenoside and may be helpful to antiviral drug discovery and development.

瘟病毒属病毒是严重危害动物养殖业的重要病毒，给畜牧业带来巨大的经济损失。同时由于其科属中的牛病毒性腹泻病毒（BVDV）与丙型肝炎病毒（HCV）在基因组结构和生活周期上的极大相似性，因而被认为是理想的抗HCV药物筛选的替代研究模型。人参具有调节免疫,抑制病毒复制等独特的作用，但人参皂苷单体抗病毒的机制尚待深入研究。本项目前期筛选到人参皂苷单体Rb2具有较强的抑制瘟病毒感染的作用。本研究拟通过细胞结合实验、荧光素酶报告基因、激光共聚焦、荧光定量RT-PCR、RNA干扰、IPA数据分析等多种技术手段从病毒和细胞两方面入手，研究Rb2对病毒生命循环的重要环节( 病毒与细胞受体相互作用、病毒重要基因合成及蛋白表达)及细胞内与病毒复制相关基因表达变化的影响，探查Rb2抑制瘟病毒复制的作用靶点与作用机制。这对探索人参皂苷的抗病毒机理，发现新的药物作用靶点开发具有我国自主知识产权的抗病毒药物具有重要意义。

瘟病毒属病毒是严重危害动物养殖业的重要病毒，给畜牧业带来巨大的经济损失。同时由于其科属中的牛病毒性腹泻病毒（BVDV）与丙型肝炎病毒（HCV）在基因组结构和生活周期上的极大相似性，因而被认为是理想的抗HCV药物筛选的替代研究模型。人参皂苷是人参主要活性成分，具有调节免疫,抑制肿瘤和抗病毒等独特的作用。本项目前期利用细胞体外感染模型，筛选到具有明显抗牛病毒性腹泻病毒和猪瘟病毒细胞内复制作用的人参皂苷单体Rb2，Rb3，Rd和Rg3。本课题将继续以Rb2为研究对象，确定其抗病毒作用机制。通过不同给药方式确定人参皂苷Rb2可以直接杀灭病毒颗粒、阻断病毒侵入细胞和抑制病毒在细胞内复制等多个环节发挥抗病毒作用。此外还具有抑制瘟病毒在细胞间病毒传递作用。研究通过real-time PCR 和westhern-lot方法确定Rb2可以抑制牛病毒性腹泻病毒核酸的复制和E2蛋白的表达。进一步通过萤火虫荧光素酶报告基因方法确定Rb2可以明显降低瘟病毒IRES的启动子活性，从而降低了病毒在细胞内复制。此外，本研究还从细胞方面确定人参皂苷Rb2对宿主细胞与病毒复制相关基因表达的影响。通过基因芯片检测转录组表达差异和IPA数据分析我们筛选出与病毒复制相关细胞基因变化显著，通过real-time PCR验证表明与IPA 数据分析一致，有病毒复制组别细胞因子相当于细胞对照组AREG,ISG15,DUSP1,PLK3,ZEB1和EGR1均升高，而加入Rb2处理组，病毒本身核酸载量降低，这些细胞因子的表达水平也明显下降。但这些基因在蛋白水平检测差异并不明显，只有AREG和DUSP1蛋白表达差异明显，有病毒复制组别蛋白表达量高，而没有病毒复制或加入人参皂苷Rb2处理后，AREG的蛋白表达量下降。该研究探查了人参皂苷Rb2抑制瘟病毒复制的作用靶点与作用机制，确定了人参皂苷主要通过抑制瘟病毒IRES启动子活性来降低病毒在细胞内复制，并通过调节细胞内AREG和DUSP1等基因的表达来发挥其抗病毒作用。这该研究对探索人参皂苷的抗病毒机理，发现新的药物作用靶点开发具有我国自主知识产权的抗病毒药物具有重要意义。