胞红蛋白在幼年小鼠急性呼吸窘迫综合征中的作用及表达调控研究

Acute respiratory distress syndrome (ARDS) is a common critical disease in childhood. It is characterized by refractory hypoxemia and has a low success rate of rescue. Cytoglobin (CYGB) is the fourth newly discovered oxygen-carrying globin, related to oxygen transport and utilization in histocyte. We set up a low-oxygen model of lung and bronchial epithelial cell and a young mice model with ARDS by injecting oleic acid, measuring the expressions of CYGB, calcineurin (CaN) signaling molecules and hypoxia-inducible factor in lung by immunohistochemistry, RT-qPCR or Western blot technique. The markers of oxidative damage and status of growth and apoptosis are also evaluated in cell and animal models. In addition, we utilize plasmid transfection technique, CYGB gene knockin and CaN signal pathway promoters to promote the expression of CYGB, observing the effects on damage or repair in lungs of ARDS model. This study aims to elucidate the effects of CYGB on ARDS and to explore the possible pathogenesis of hypoxemia in ARDS from the point of view of oxygen transport, storage and utilization. We also try to illustrate the signal pathways on how to regulate the CYGB expression in an effort to find the new way for future intervention on ARDS. The study will also lay a solid foundation on the research of oxygen metabolism in other critical diseases.

急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是儿童时期常见的危重病，主要特点是顽固性低氧血症，抢救成功率低。胞红蛋白（CYGB）是新发现的第四种携氧珠蛋白，与组织细胞的氧输送及氧利用有关。本研究以肺和支气管上皮细胞制作低氧细胞模型，用油酸制作幼年小鼠ARDS模型，采用免疫组化、RT-qPCR和Western blot技术，测定肺组织细胞CYGB、钙调神经磷酸酶 (CaN)信号通路蛋白、低氧诱导因子的表达变化，以及肺组织细胞氧化损伤、生长凋亡指标。同时利用质粒转染技术、基因敲入技术、CaN信号通路促进剂，促进CYGB的表达，观察对ARDS组织损伤及修复的影响。本研究通过阐明CYGB在ARDS发病中的作用，从机体氧运输、氧储存和氧利用的角度，探讨ARDS发生低氧血症的可能机制，并通过阐明CYGB表达调控的信号途径，为今后的治疗干预寻找方向。结果也将为其它危重疾病在氧代谢方面的研究奠定坚实的基础。

本项目执行四年来，按照项目计划书，顺利完成了各项研究内容。通过体外细胞和体内动物学实验，对CYGB在急性肺损伤作用及信号转导机制进行了系统研究和论证，并结合最新的研究进展，以内外源CYGB为调控对象，以抗细胞损伤、血管通透性、炎症机制为出发点，通过多种生物学检测方法，研究了内外源性CYGB对急性肺损伤作用的分子机制。取得的主要成果如下：.（1）10%低氧和1%缺氧能够诱导MLE12细胞中，CYGB和CaN/NFAT/AP-1信号通路的表达变化，这时间的变化同模拟临床ARDS的变化以及肺血管通透性的变化较为一致。这暗示增加应激过程中CYGB的表达为靶向目标可能对ARDS具有潜在治疗作用。项目进一步构建了分子和化学两种，发现过表达CYGB、CaN/NFAT/AP-1信号通路两个广泛的激活剂DPCA和IOX2，均能够上调CYGB的的表达水平。.（2）在MLE-12细胞中，项目验证了三种上调CYGB方式的作用。结果发现，过表达CYGB或IXO2均能上调CYGB，拮抗低氧和缺氧下细胞的增殖减缓和凋亡增加，抑制10%低氧和1%缺氧诱导的细胞氧化应激反应，以及抑制低氧或缺氧在内皮细胞中诱导的通透性增加。.（3）项目利用油酸诱导ARDS动物模型，通过qPCR和western blot再次明确了CaN/NFAT/AP-1信号通路参与了ARDS过程，同CYGB上调相关。在油酸诱导ARDS动物模型中，验证了眼眶后注射CYGB或者IOX2能够拮抗油酸诱导的小鼠ARDS病症，包括改善肺部病理学特征，降低了肺部细胞凋亡率，缓解炎症反应，降低肺部血管通透性；其中IOX2的效果较过表达CYGB更为显著。进一步通过qPCR、免疫组化和免疫印迹检测明确了CaN/NFAT/AP-1信号通路在其中发挥重要作用。.本项目的研究结果明确了CaN/NFAT/AP1-CYGB信号通路在急性肺损伤发生发展的作用，阐明了上调CYGB在急性肺损伤的保护作用，为CYGB在急性肺损伤的治疗进行了有益的尝试，并为急性肺损伤药物筛选提供新的选择。