WIF-1基因甲基化修饰对动脉粥样硬化的作用及机制研究

Atherosclerosis is the main cause of myocardial infarction or stroke, but the mechanisms of atherosclerosis is complicate. There have several theories about atherosclerosis, but none of them could give satisfied answer. Epigenetics means regulation of gene expression by modifying the DNA methylation, histone and long chain non-coding RNA withou changing the DNA sequecne. DNA methylation is the most common epigenetics phenomen. Our clinical study showed that some gene methylation levels was significantly higher than normal persons, animal studies found that azacytidine (5-aza), one specific DNA methylation inhibitor, could inhibit the progress of atherosclerosis in animal model. After bioinformatic analysis, we found that the methylation of Wnt inhibitor factor-1 (WIF-1) may play important roles in atheroma. We plan to study the mechanism and function of WIF-1 in vascular smooth muscle cell by pyrosequence, western blot, luciferase report gene, CHIP, etc. Furthermore, we attempt to study the function and mechanisms of WIF-1 in atherosclerosis by transfecting lentivirus to ApoE-/- mouse. We hope that this study would improve our understanding the roles of epigenetics in atherosclerosis and provide new idea in prevention and treatment of atherosclerosis.

动脉粥样硬化是冠心病、脑卒中等疾病的主要原因。动脉粥样硬化的发病机制复杂，多种学说都不能很好解释动脉粥样硬化的机制。表观遗传学是指在不改变基因组序列的前提下，通过DNA、组蛋白修饰等来调控基因表达，其中DNA甲基化是最常见的表观遗传修饰。我们前期临床研究证实冠心病患者部分基因甲基化水平明显高于正常人,动物实验发现甲基化抑制药物5-aza能明显减轻动脉粥样斑块，生物信息学分析显示WIF-1基因的甲基化修饰可能在动脉粥样斑块中起主要作用。申请者拟在后续工作中通过焦磷酸盐测序、Western blot、荧光素酶报告法、染色质免疫共沉淀等技术研究WIF-1基因甲基化修饰机制以及对血管平滑肌功能影响。体内研究，通过构建WIF-1和siRNA慢病毒等实验探讨WIF-1基因对ApoE-/-小鼠动脉粥样斑块的影响和机制。此研究将有助于了解表观遗传在动脉粥样硬化中的作用，为动脉粥样硬化的防治提供新的思路。

动脉粥样硬化是冠心病、脑卒中等疾病的主要原因，但是多种学说都不能很好解释动脉粥样硬化的机制。我们前期临床研究证实冠心病患者部分基因甲基化水平明显高于正常人，动物实验发现甲基化抑制药物5-aza能明显减轻动脉粥样斑块但是两组小鼠血糖、血脂水平无明显差异。主动脉油红O染色分析显示，5-aza组主动脉斑块面积明显减少（5-aza组20.1% ± 2.2% vs. 生理盐水组30.8% ± 7.5%, P=0.016），主动脉瓣口冰冻切片亦显示5-aza组斑块面积明显减少，此外，斑块内巨噬细胞含量明显减少。同时，我们收集三组小鼠主动脉组织蛋白，与正常饮食的C57BL/6小鼠相比，高脂饮食Apoe-/-小鼠的甲基化转移酶（DNMT1）表达水平无明显改变，而DNMT3a表达升高，给予5-aza治疗后，DNMT1和DNMT3a表达均无明显下降。Apoe-/-小鼠的DNMT酶活性较C57BL/6对照组小鼠升高，而当给予5-aza治疗后，DNMT活性受到明显抑制。提取三组小鼠主动脉DNA，生理盐水组5’-碳甲基化（5-mc）含量较正常组明显升高，而给予5-aza治疗后5-mC水平回落到正常水平。接下来，我们探讨DNA去甲基化调控动脉粥样硬化发展的潜在机制。与正常组小鼠相比，我们观察到生理盐水组的Apoe-/-小鼠主动脉5’-碳羟甲基化（5-hmC）较其他两组均明显降低。同样，与正常组小鼠相比，Apoe-/-小鼠主动脉5-hmC 转移酶Tet2蛋白水平明显受到抑制，而给予5-aza治疗后Tet2表达又升高。进一步研究发现生理盐水组Tet2启动子区呈高甲基化水平，而5-aza组Tet2甲基化水平明显改善。结合既往文献报道，我们发现5-aza治疗组较生理盐水组的5-hmC富集程度更高，而5-mC含量更低，相应Myocardin表达水平也更高。该部分结果揭示5-aza通过改善Tet2启动子区高甲基化水平，从而回复全基因组羟甲基化含量，同时，也提高Myocardin基因启动子区域的5-hmC水平，恢复Myocardin表达水平。研究结果发表在Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2017;37(1):84-97. (IF=6.6)