白腐真菌降解多环芳烃过程中P450的表达谱及调控规律

多环芳烃污染是亟待解决的重要环境问题；白腐真菌黄孢原毛平革菌是目前所知P450基因最丰富的微生物之一，其P450降解功能突出并受许多污染物的诱导，在多环芳烃等难降解有机污染的监测、治理乃至毒理学分析等方面均有突出的研究价值。但相关P450基因型不明、调控规律未知，极大制约了该真菌P450的研究与应用。本研究拟采用基因芯片技术，解析黄孢原毛平革菌降解菲过程中P450的基因表达谱，依据基因表达谱差异与P450活性的相关性筛选出与菲降解相关的P450基因；采用实时定量逆转录PCR技术，研究不同条件下相关P450基因表达水平的变化规律，并综合P450活性的变化规律和基因表达谱分析的结果，揭示菲降解过程中P450的调控规律。本研究有利于深入理解和充分开发白腐真菌及其P450突出的降解功能，能够为多环芳烃污染的监测和治理提供新的生物资源。

本课题采用白腐真菌模式菌种黄孢原毛平革菌，通过特征产物分析、酶活检测、基因芯片、高通量测序等技术，建立了该真菌P450对菲的特征降解活性检测方法，针对该真菌降解菲的过程，解析了关键降解酶系P450和MnP的活性变化规律、转录组功能基因多样性及典型营养条件下基因表达谱的差异，并比较了萘、菲、芘三种典型多环芳烃诱导的P450基因表达谱。研究表明：（1）在营养丰富的原生代谢阶段，主要由 P450催化菲的9,10位与3,4位加氧反应；进入营养受限的次生代谢阶段后，P450逐步转为仅催化菲的9,10位加氧反应，活性逐步下降，MnP催化菲的双加氧反应，活性显著增强并相对稳定，逐渐占主导。（2）该真菌降解菲的转录组共检出10,048个基因，占预测基因总数的85%，表现出丰富的功能类型，其中包括142个P450基因。（3）营养丰富条件下，P450基因家族cyp5145A、5136A、5144A、5148A的部分基因在降解菲样本中表达明显上调，与此相应，与菲代谢过程可能相关的双加氧酶、氧化还原蛋白、黄素蛋白合成酶以及lipA、lipD等46个基因表达显著上调，而部分与碳代谢相关酶系乃至结构蛋白等85个基因表达显著下调。营养限制条件下，P450基因cyp5163A3、cyp5152A2等在降解菲样本中显著上调，相应显著上调的74个基因中不仅包括一些氧化酶及氧化还原蛋白的基因，还包括许多碳代谢功能基因，仅有19个基因明显下调，其中包括mnpH1。该真菌仅有的1个P450氧化还原蛋白CPR在不同条件下均保持着较高的转录水平。营养条件表现出对包括P450在内的多类功能酶系基因表达显著的调控作用。（4）P450转录调控与进化距离没有明显相关性。不同多环芳烃诱导的P450表达谱与多环芳烃的结构有一定相关性，并受培养条件的显著影响。