基于微流控芯片的生物人工肝细胞状态检测方法研究

生物人工肝支持系统(BALSS)在维系急性肝衰患者生命、争取肝功能主动恢复上具有显著疗效，而掌握BALSS内培养的肝细胞状态并及时调整营养物质供应是保障细胞活性和疗效的关键。目前，在长时间连续培养中检测样品消耗量巨大且为离线检测，微量、实时在线检测细胞存活状态是BALSS亟待解决且具有挑战性的课题。为此，本项目提出适于在线微量监测的细胞状态评价指标体系，将基于MEMS的微流控芯片应用于BALSS，通过仿真优化多参数检测芯片结构，解决样品用量过大且无法实时闭环调控细胞状态的问题，同时探索检测芯片与生物反应器一体地以舍弃方式使用的相关问题。本项目预期以微量在线检测出细胞状态，为精细控制细胞培养和生长过程奠定基础，并对与生物反应器一体化的低成本舍弃式传感器作出有益研究，最终为延续重症肝病患者生命作出贡献。本项目在如细胞大规模培养等组织工程领域、床旁监护以及生化在线监测中具有普遍意义。

肝衰竭是一种死亡率高达80%的疾病，随着肝移植等治疗手段的限制，生物人工肝的研究对于治疗肝衰竭显得越发重要。生物反应器内微环境的调控对肝细胞状态乃至生物反应器的疗效至关重要。目前，国内外对生物反应器内肝细胞状态的检测多是离线检测，操作繁琐且不利于及时反馈信息进行调控。. 基于此，本项目重点研究了用于生物人工肝细胞状态在线、实时微检测的方法，选取合适的肝细胞功能评价指标，设计微量、高效的微混合检测芯片，构建光学检测平台，实现了肝细胞实时在线微检测的目的。主要工作包括：1、肝细胞状态实时在线评价指标选取。通过文献和临床调研，选取可反映肝细胞损伤度的丙氨酸氨基转移酶（ALT）和可反映肝细胞解毒代谢功能的尿素（Urea）来分别反映肝细胞状态和功能，构成肝细胞状态实时在线评价体系。根据所选取指标的生化特性以及可实现性，均采用光学比色法检测样品（血清）中的ALT和Urea浓度来反映肝细胞生长状态和功能的发挥。2、微混合芯片的设计加工。通过ANSYS-Fluent仿真设计了菱形串联式结构的微混合芯片，通过微沟道结构的不断分、合实现了液体流速方向与浓度梯度方向多次一致的效果，提高混合效率以达到快速检测的目的。采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）制作了微混合芯片，微混合芯片总体积约17μL，当检测ALT时血清消耗量为1.55μL，当检测Urea时消耗量为0.1717μL，实现了微量检测。3、微检测平台的搭建。根据微混合芯片结构和选取指标的检测要求，设计了光学比色法的微检测平台，结合稀释分配器、氘光源和光谱仪构成了微检测平台，用于进行微混合芯片的在线检测。4、实验验证。对含不同浓度的ALT和Urea的血清样品进行检测实验，微混合芯片自动检测结果与计算参考值成良好的线性相关度，ALT相关系数为0.999787且残差模仅为1.7541 U/L，Urea相关系数为0.999829且残差模仅为0.11728 mmol/L。微混合芯片实现了在线快速、微量检测的目的。5、微检测芯片结构优化。对在线检测中微混合芯片的不足进行优化仿真计算，设计出同时满足高效混合与低压差的新型立体交错型微混合模型。. 利用本项目建立的细胞功能状态在线微检测方法，可实现对病人进行长时间、连续、微量自动检测的目的，为优化生物反应器内肝细胞状态奠定了基础，对于提高生物人工肝的疗效具有重要意义。