TGFβ依赖性RGC32基因表达在巨噬细胞诱导的大肠癌上皮间质转化中的作用机制研究

Our prior researches finded that TGFβ can promote Renal tubular epithelial cells to express RGC32 and regulate Renal tubular cell EMT; meanwhile, RGC32 can promote EMT progress by Smad2/3 pathway upregulating the expression of SMA; Simultaneously ,Our experiment finded that colorectal cancer cells have significant EMT morphological changes when co-cultured with macrophages cells, TGFβ can increase the expression of RGC32 in colorectal cancer cells also, therefore,we hypothesize that tumor associated macrophage(TAM) can promote colorectal cancer cells EMT progress by TGFβ-RGC32-Smad2/3 pathway and promote metastasis. .This project try to overexpress and knockdown RGC32 in colorectal cancer cells respectively , and co-culture with TAM and then detect the expression of EMT protein、TGF、Wnt signal pathway proteins, the activity of SMA、E-cadherin promoter and the changes of colorectal cancer biological behaviour; exploring the relationship between TAM, TGFβ、Wnt signal pathway and colorectal cancer metastasis; Using Visual colorectal cancer metastasis model to observe the role of TAM and RGC32 in colorectal cancer metastasis. Exploring the mechanism of TGFβ-dependent RGC32 expression on macrophage-induced EMT of colorectal cancer.

前期研究发现TGFβ能刺激肾小管上皮细胞表达RGC32并通过Smad2/3途径上调SMA的表达而调控肾小管上皮发生EMT，TGFβ刺激能使大肠癌细胞RGC32表达增高，将巨噬细胞与大肠癌细胞共同培养也能使大肠癌细胞发生EMT表型；因此我们提出肿瘤相关巨噬细胞通过TGFβ-RGC32-Smad2/3途径促进结直肠癌细胞EMT从而促进转移的假说。本课题拟过表达和沉默结直肠癌细胞RGC32基因后与巨噬细胞共同培养，分析其EMT 、TGFβ、Wnt信号通路蛋白的变化以及SMA、E-cadherin启动子活性及其生物学行为变化，阐明巨噬细胞诱导的RGC32 基因所调控的信号传导通路；然后利用可视化大肠癌转移模型，将过表达和沉默RGC32基因的结直肠癌细胞分组原位接种并在裸鼠腹腔内注入巨噬细胞，观察肿瘤相关巨噬细胞对大肠癌转移影响及作用机制。

Response gene to complement 32(RGC32)是一种能调控细胞生长、增殖及分化的基因。本课题组前期研究发现TGFβ 能刺激肾小管上皮细胞表达RGC32 并通过Smad2/3 途径上调SMA 的表达而调控肾小管上皮发生上皮间质转化。我们进一步研究了RGC32在结直肠癌发生发展中发挥的作用及机制。本研究首先揭示了RGC32在结直肠癌组织和细胞中表达均显著增高，并且RGC32的高表达与结直肠癌患者的侵袭转移特性及不良预后相关。其次，我们用结直肠癌细胞构建稳定过表达和沉默RGC32的细胞，发现RGC32促进直肠癌细胞体内外的增殖和侵袭能力。接下来，将结直肠癌细胞与巨噬细胞共培养后，发现巨噬细胞TGFβ分泌增多，进一步促使结直肠癌细胞中RGC32的表达增加，Smad蛋白磷酸化并发生入核，Smad信号通路激活。另外，western blot结果证实共培养后，结直肠癌上皮性标志物表达降低，间质性标志物表达增加，提示结直肠癌细胞发生EMT。最后，我们还检测了RGC32对Wnt信号通路的影响，发现干扰RGC32表达后，细胞内Wnt 信号未被激活。这些结果提示，巨噬细胞通过其分泌的TGFβ细胞因子作用于结直肠癌细胞，激活Smad信号通路，诱导结直肠癌细胞发生EMT。