猪繁殖与呼吸综合征病毒 Nsp4 蛋白纳米抗体抗病毒机制研究

Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) is a highly infections diseases caused by porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), which has a serious hazard to the swine industry in China. In our previous study, PRRSV Nsp4-specific nanobodies were isolated, two of them could potently inhibited the replication of PRRSV SD16 strain, but the antiviral mechanism is still unknown. In this project，the impact of Nsp4-specific nanobodies on the replication of other PRRSV strain will be evaluated. Subsequently，the impact of Nsp4-specific nanobodies on the protease activity of Nsp4 will be detected using both in vitro experiments and intracellular experiments. To analyze the epitopes of Nsp4 recognized by nanobodies and the impact of nanobodies on the conformation of Nsp4, the crystal structure of Nsp4-nanobody complex will be solved through single crystal X-ray diffraction technique. The function of the key amino acid of Nsp4 recognized by nanobodies will be verified using reverse genetics method. The objective of the project is to illustrate the antiviral mechanism of Nsp4-specific nanobodies and afford novel theoretical basis for the antiviral mechanism of nanobodies. The implementation and the result of the project will be conducive to well understanding of the biological functions of Nsp4 in the PRRSV life cycle, and hopefully provide new antiviral targets for the designing of anti-PRRSV drugs.

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种烈性传染病，对我国生猪产业危害严重。在前期的研究中，我们筛选到了PRRSV Nsp4特异性纳米抗体，其中两株对SD16毒株的复制具有强烈的抑制作用，但其抗病毒机制依然未知。本项目拟通过病毒感染实验，筛选对多种PRRSV毒株具有抗病毒活性的纳米抗体，并通过体外实验和细胞内实验，检测纳米抗体对Nsp4蛋白酶活性的影响；利用单晶X射线衍射技术，解析Nsp4-纳米抗体复合物结构，确定纳米抗体结合Nsp4的关键氨基酸及其对Nsp4构象的影响；借助反向遗传操作技术，验证关键氨基酸位点的功能。本课题旨在从分子水平上阐明PRRSV Nsp4蛋白纳米抗体的抗病毒机制，为纳米抗体抗病毒机制提供新的理论依据，项目的实施也将有助于我们深入了解Nsp4蛋白的生物学功能，为进一步研制新型抗PRRSV药物提供新的靶标。

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种烈性传染病，对我国生猪产业危害严重。在之前的研究中，我们筛选到了PRRSV Nsp4特异性纳米抗体，其中两株对SD16毒株的复制具有强烈的抑制作用，但其抗病毒机制依然未知。本研究中我们进一步检测了Nsp4纳米抗体对多种PRRSV毒株复制的影响，结果表明，胞内表达的Nb41和Nb43可以抑制多种PRRSV毒株（SD16、JX-A1、GD-HD、VR-2332）在MARC-145细胞中的增殖。然后我们利用原核表达系统表达并纯化了Nsp4-GST融合蛋白，经PreScission Protease蛋白水解酶，纯化到了无标签Nsp4蛋白，利用凝胶过滤层析法对Nsp4蛋白进行进一步纯化，得到了高纯度可溶性Nsp4重组蛋白。同时我们利用酵母表达系统表达了纳米抗体Nb41和Nb43，蛋白产率分别为110mg/l培养基和123mg/l培养基，ELISA结果表明，所纯化的纳米抗体与Nsp4蛋白具有较好的反应性。将纳米抗体与Nsp4蛋白共孵育，通过凝胶过滤层析法分离纯化复合物，利用商品化晶体筛选试剂盒结合蒸汽扩散坐滴法，制备Nsp4-Nb43复合物晶体，用SSRF BL17U线站收集到了高质量的蛋白质晶体衍射数据并解析了Nsp4-Nb43复合物晶体结构。本研究通过病毒感染实验证实了Nsp4特异性纳米抗体对多种PRRSV毒株均具有抗病毒活性；制备了 Nsp4-Nb43复合物晶体，并解析了其晶体结构，确定了Nb43结合Nsp4的关键氨基酸位点，发现了Nsp4蛋白新的功能位点，为进一步研制以PRRSV Nsp4蛋白为靶标的抗病毒药物奠定了基础。