Neto1介导NMDA受体运输在慢性神经痛所致前扣带回突触重塑中的作用和机制研究

Neto1, as a new auxiliary protein of NMDA receptor constructing protein compounds of synaptic ionotropic receptors mediates trafficing of NMDA Receptor in hippocampus. However, it is not clear whether it plays an important role in modulating synaptic plasticity of anterior cingulate cortex (ACC) induced by neuropathic pain (NP). We will create of NP rat models by chronic constriction injury (CCI) of sciatic nerve. After 14 day Lentiviral vectors of Neto1-siRNA transfected into ACC area of normal living rats by stereotaxic injection, we will give the same injury to these animal and have another NP models. Including control and sham operated animals,we will have total 6 group animals. Changes of pain feeling, pain avoidance response and conditional space avoidance response which are related to ACC area will be detected after CCI 3, 7, 14, 21 and 28 day. Then, the positive animals will be selected and killed. The surface proteins of neuron in ACC area will be biotinylated and selectively purified by magnetic beads. The expression level of Neto1, NMDA receptor subunits NR2A and NR2B will be quantitatively detected by Western blotting. The correlation of these three proteins expressed in cellular membrane and synaptic plasticity will be analyzed. We hope to investigate the mechanism of synaptic plasticity of anterior cingulate cortex induced by NP in rats. Our data will help to develop elective drugs interfering in creation and development of some potential negative emotion.

Neto1蛋白是一种新的NMDA受体辅助蛋白，参与构成突触性离子型受体蛋白复合物，具有介导海马NMDA受体跨膜运输的作用。它是否在神经病理性痛引起的前扣带回（ACC）的突触重塑中起到重要作用尚不清楚。本研究建立坐骨神经压迫（CCI）引起的神经病理性痛（NP）大鼠模型，并用立体脑定点注射的方法将Neto1-siRNA慢病毒表达载体转染正常活体大鼠ACC部位神经元，14天后建立相同的NP模型，分别于CCI术后3,7,14,21和28天检测其痛觉改变和与ACC密切相关的痛回避反应和条件性空间回避反应。随后，对阳性动物用生物素和磁珠选择性纯化ACC部位的神经元表面蛋白并用蛋白印迹的方法定量检测Neto1、NMDA受体亚型NR2A和NR2B的表达水平，分析3种蛋白在细胞膜上表达的相关性和突触重塑。本研究探讨NP引起的ACC部位的突触重塑的新机制，为研发NP引起的负性情绪发生、发展的治疗药物提供依据。

目的 观察神经病理性痛大鼠行为学变化、痛厌恶情绪及前扣带回部位Neto1、NR2A和NR2B的mRNA的表达， 探讨Neto1 对NMDA受体重塑作用及痛相关厌恶情绪的产生的影响，为干预神经病理性痛提供新的备选方案。.方法 30只体重180g～200g的雌性Wistar大鼠随机分为三组 (每组10只)：空白对照组（control group，Con组），假手术组（sham operated group，SO组），神经病理性痛模型组（NP group，NP组）。采用慢性坐骨神经压迫法制作NP模型。各组大鼠分别于术前和术后第7、14、21和28d检测术侧后爪机械缩足阈值（withdrawal mechanical threshold，WMT）和热缩足潜伏期（thermal withdrawal latency，TWL）。于术后28d采用明暗箱实验进行痛厌恶情绪的行为学检测。对行为学阳性动物用RT-PCR方法测定ACC部位Neto1基因、NR2A 亚基及NR2B 亚基mRNA的相对表达量。 随后，采用Neto1-siRNA的方法干预培养的人的神经源性细胞SK-N-SH，观测NR2B、NR2A mRNA的表达变化。.结果 1.行为学观察和痛阈的变化 NP大鼠术侧足跛行，足趾蜷缩，足掌不能平伸着地，保护性用健侧肢体支撑体重等表现，术后无自噬及感染现象，SO组无明显异常。NP大鼠术侧足在各时间点测定的机械痛阈及热痛阈与术前测定的基础值相比较，显著性降低（P＜0.05）；与Con组及SO组相比较，NP组大鼠机械痛阈、热痛阈明显下降（P＜0.05）。2.痛厌恶情绪行为的测定 由于大鼠天性喜暗，正常大鼠在暗侧停留时间占总实验时间的比例平均大于70%，假手术组动物在暗侧停留时间也平均大于60% ，但NP组动物在暗侧停留时间显著少于SO及Con组动物（P＜0.05）。3.Neto1、NR2A和NR2B mRNA的表达水平 与Con组及SO组比，NP组动物Neto1 、NR2A和NR2B mRNA的表达明显上调。在培养的SK-N-SH细胞水平，Neto1 mRNA的低表达引起NR2A和NR2BmRNA水平的高表达，但不引起细胞形态学的改变。.结论 ACC部位的Neto1高表达和NMDA受体重塑可能调控NP所诱导的疼痛厌恶情绪的发生。