miR-1283调控ATF4/CHOP通路在高血压病血瘀证形成中的作用及机制研究

On the basis of previous work, we plan to use the CRISPR-Cas9 and overexpression plasmid prokaryotic microinjection technologies to knock out and high express miR-1283 in SD rats; Spontaneously hypertensive rats will be given antagomir or agomir of miR-1283 to inhibit or high express miR-1283; In vitro experiment, the human aortic endothelial cells will be intervented with antagomir or agomir of miR-1283. Combined with the experiments in vivo and vitro, we will reveal the function of miR-1283 and its role in the development of blood stasis syndrome of hypertension. Secondly,we inhibit miR-1283 and ATF4/CHOP signaling pathway simultaneously in human aortic endothelial cells to clarify whether the role of miR-1283 in the development of blood stasis syndrome of hypertension is depended on ATF4/CHOP signaling pathway. Finally, this study will illuminate the intervention effects of Taohong Siwu Decoction on miR-1283 and ATF4/CHOP signaling pathway according to the correspondence between prescription and syndrome. It will provide new measures of prevention and treatment of hypertension, thus, it has important theoretical signficance and clinical value.

本项目在前期工作基础上，拟首先采用正常SD大鼠，使用CRISPR-cas9和过表达质粒原核显微注射技术，敲除和过表达miR-1283；采用自发性高血压大鼠，给予miR-1283antagomir和miR-1283agomir，抑制和过表达miR-1283；并利用人主动脉内皮细胞，给予miR-1283antagomir和miR-1283agomir。结合体内外实验，揭示miR-1283的功能及其在高血压病血瘀证形成中的作用。其次，利用人主动脉内皮细胞，同时抑制miR-1283以及ATF4/CHOP信号通路，弄清miR-1283对高血压病血瘀证形成的影响是否依赖于ATF4/CHOP信号通路。最后，基于方证相应原理，阐明活血化瘀代表方桃红四物汤对miR-1283及其调控的ATF4/CHOP信号通路的干预效应。为防治高血压病提供新的策略，具有重要理论意义和临床应用价值。

目的：揭示miR-1283调控高血压病血瘀证血管内皮细胞功能障碍的分子机制。方法：通过转录组测序验证miR-1283与ATF4在HAEC中的靶标和调控关系；利用Cas9基因编辑技术构建C57BL/6J ATF4基因敲除小鼠模型；通过细胞转染技术过表达和抑制miR-1283细胞模型；通过桃红四物汤干预自发性高血压大鼠；通过慢病毒构建过表达ATF4小鼠模型，同时高盐诱导建立高血压小鼠模型；通过网络药理学揭示桃红四物汤干预高血压的机制。结果：1.在HAEC中miR-1283与ATF4之间存在靶标和调控关系。2.成功建立ATF4基因敲除小鼠模型，敲除ATF4基因能抑制高盐饮食诱导的血压升高；3.ATF4+/-小鼠ET-1、EPCR、TM、vWF、PAI减少，NO、tPA增加；抑制HAEC中的miR-1283能导致NO降低、ET-1、EPCR、TM、vWF升高，致使细胞内皮功能障碍，而过表达miR-1283能改善这种结果；4.ATF4+/-小鼠通过下调ATF4、CHOP mRNA和蛋白的表达；抑制HAEC中的miR-1283能导致ATF4、CHOP mRNA和蛋白的上调，而过表达miR-1283能改善这种结果；5.ATF4+/-小鼠通过下调BID、BIM、Caspase-3，上调BCL-X、BCL-2 mRNA和蛋白的表达抑制细胞凋亡；抑制HAEC中的miR-1283能导致BID、BIM、Caspase-3 mRNA和蛋白的上调，BCL-X、BCL-2 mRNA和蛋白的下调，而过表达miR-1283能改善这种结果；5.桃红四物汤中化合物黄芩素、β谷固醇、山奈酚、木犀草素、杨梅黄酮和槲皮素在防治高血压病中发挥主要作用。通过差异基因的富集显示桃红四物汤可能通过游PI3K/AKT等信号通路调控血压。6.桃红四物汤降低大鼠血压，改善血液流变学，提高内皮依赖性舒张功能，改善内皮源性相关因子水平，同时抑制内质网应激ATF4/CHOP通路相关基因的表达；7.ATF4参与调控高血压内皮功能障碍与肠道菌群有关。结论：miR-1283可通过抑制其靶基因ATF4的表达调控高血压病血瘀证血管内皮细胞功能障碍，其机制与ATF4/CHOP介导的内质网应激和内皮细胞凋亡以及肠道菌群有关。