三疣梭子蟹蜕皮抑制激素基因表达及生理功能的研究

三疣梭子蟹是我国海水人工增养殖的主要种类之一。在已经对三疣梭子蟹蜕皮抑制激素（MIH）全长cDNA进行分子克隆和序列分析、采用大肠杆菌表达系统获得MIH重组蛋白和制备重组MIH（rMIH）多克隆抗体的基础上，本项目拟进一步通过RT-PCR和定量PCR技术分析三疣梭子蟹MIH基因的组织特异性表达、在蜕皮周期中的表达水平变化和在卵巢发育过程中的表达水平变化；通过免疫细胞化学方法定位合成MIH的眼柄神经分泌细胞；建立蜕皮类固醇分离、定量检测方法，通过离体培养和活体注射相结合的生物活性分析实验探讨rMIH对三疣梭子蟹蜕皮和卵巢发育的调控作用。开展三疣梭子蟹MIH基因表达和生理功能的研究，将有助于阐明MIH在三疣梭子蟹蜕皮和卵巢发育过程中的分子调控机制，丰富甲壳动物神经内分泌学理论；将为解决三疣梭子蟹人工增养殖中所遇到的蜕皮未遂、性早熟和卵巢发育不良等难题提供理论指导。

应用基因组步移技术克隆了三疣梭子蟹蜕皮抑制激素（MIH）基因组全长序列。三疣梭子蟹MIH基因的的表达具有组织特异性，在眼柄X器-窦腺复合体（XO-SG）中表达最强。对重组MIH（rMIH）进行了纯化、复性和质谱鉴定，理论推导的氨基酸序列（ABZ04547）有两条肽段与重组MIH蛋白完全匹配，序列分别为-VEWICDDCANIYR- 和–DCFFNEDFLWCVR-。rMIH分子量为12660.2617Da，具有4个二硫键。依据形态学变化将三疣梭子蟹蜕皮周期划分为蜕皮后期、蜕皮间期、蜕皮前期和蜕皮期。根据甲壳硬度变化将蜕皮后期细分成A期和B期；根据游泳足趾节末端新旧表皮基线间距/旧表皮厚度的比值并结合解剖后新壳的生长状况，蜕皮前期被细分为D0亚期、D1亚期、D2亚期、D3亚期和D4亚期。建立了利用HPLC-QqQ MS测定三疣梭子蟹血淋巴20-羟基蜕皮酮浓度的方法，检出限为0.03 μg/L。采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析了眼柄XO-SG中MIH基因在三疣梭子蟹蜕皮周期中的表达水平变化。结果表明：从D0亚期至D4亚期，MIH基因表达量逐渐降低；蜕皮后MIH基因表达量再逐渐升高到蜕皮间期达到顶峰。在蜕皮周期中，血淋巴20-羟基蜕皮酮浓度与MIH基因表达量呈现拮抗性，揭示MIH通过抑制Y器合成蜕皮激素而调控三疣梭子蟹蜕皮过程。通过活体注射和离体培养相结合的生物活性分析实验探讨了rMIH对三疣梭子蟹蜕皮的调控作用。结果表明：活体注射rMIH能降低血淋巴20-羟基蜕皮酮浓度；活体注射rMIH和XO-SG提取物相比注射蟹生理盐水能显著延长蜕皮周期；Y器分泌蜕皮酮的水平随着离体培养液中rMIH浓度的增加而下降。因此，rMIH具有抑制三疣梭子蟹蜕皮的生物学活性。采用qRT-PCR技术分析了三疣梭子蟹二次卵巢发育过程中眼柄XO-SG中MIH基因和卵巢、肝胰腺中Vg基因的表达水平变化。结果表明，卵巢和肝胰腺中Vg基因的表达水平与卵巢发育正相关，眼柄XO-SG中MIH基因的表达水平与卵巢发育负相关。rMIH能抑制卵巢和肝胰腺离体组织块Vg基因的表达，进一步表明MIH能抑制三疣梭子蟹卵巢发育。这些研究成果不仅在丰富甲壳动物神经内分泌学理论方面具有重要的理论意义，而且能为解决三疣梭子蟹人工增养殖中所遇到的蜕皮未遂和卵巢发育不良等难题提供理论指导。