玉米花粉特异胞质类受体蛋白激酶ZmSTK1_USP调控花粉萌发和花粉管生长的机制研究

Pollen germination and pollen tube growth, which is regulated by a large number of signal pathways, is an important event during sexual reproduction in plants. . Our research group first found a pollen-specific cytoplasmic receptor-like protein kinase (RLCK) with the Usp receptor domain from maize, named ZmSTK1_USP. The present project will use GFP as a marker to position the expression of ZmSTK1_USP in the germinating pollens and growing pollen tubes; use the analysis of pull-down, Co-IP, phosphorylation and bimolecular fluorescence complementation to screen ligands and substrate proteins of ZmSTK1_USP; clone the encoding genes of ligand and substrate proteins; evaluate the effect of RNAi- mediated gene silencing of ligand and substrate proteins on pollen germination and pollen tube growth; explore the novel signal transduction pathway of "ligand-ZmSTK1_USP-substrate protein"; provide scientific basis for the mechanism of pollen germination and pollen tube growth regulated by the pollen-specific RLCK-USP protein kinases. . These results can not only enrich our understanding of pollen germination and pollen tube growth which are important links of sexual plant reproduction, but also provide theory support for the in-depth understanding of the controling mechanism of plant fertilization and reproduction.

花粉萌发与花粉管生长是植物有性生殖过程中的重要事件，受大量信号通路的调控。课题组从玉米中首次发现具Usp受体结构域的花粉特异胞质类受体蛋白激酶（RLCK），命名为ZmSTK1_USP。目前尚未有此类激酶调控花粉萌发和花粉管生长的报道。.本项目以GFP为标记对ZmSTK1_USP在萌发花粉及生长花粉管中的表达进行定位；利用pull-down、Co-IP、磷酸化分析以及双分子荧光互补分析筛选ZmSTK1_USP配体及底物蛋白，克隆编码配体和底物蛋白的基因，评估RNAi介导的配体和底物蛋白基因沉默对花粉萌发和花粉管生长的影响，探索新的“配体-ZmSTK1_USP-底物蛋白”参与的信号转导途径，为花粉特异RLCK-USP类蛋白激酶调控花粉萌发和花粉管生长机制提供科学依据。这一研究不仅能丰富我们对花粉萌发和花粉管生长这一植物有性生殖重要环节的理解，也将为深入了解植物受精及繁殖的控制机理等提供理论支持

玉米花粉发育正常与否直接决定受精能否正常进行，因此是影响玉米产量的重要因素。近些年，花粉发育的调控机理是作物生物学研究的热点问题。本研究前期利用转座子插入的方法获得了一个花粉发育异常的玉米突变体zmstk1_usp。该突变体花粉萌发率、碘-碘化钾染色率和结实率显著降低。本研究通过对ZmSTK1_USP蛋白的亚细胞定位、底物蛋白鉴定和验证以及蛋白调控花粉发育的机制等问题进行了研究，为深入揭示花粉发育调控机理奠定理论基础。本项目研究发现，造成突变表型的ZmSTK1_USP基因编码一个胞质类受体蛋白激酶。植物类受体蛋白激酶属于一大类蛋白激酶，在植物的生长、发育、逆境胁迫和生殖过程中发挥着重要功能。.生物信息学分析结果表明，该蛋白属与类受体蛋白激酶IX-b亚家族成员。ZmSTK1_USP在花粉中特异表达。表达自三细胞时期花粉中开始表达，成熟花粉中表达量最高。ZmSTK1_USP蛋白定位在花粉和花粉管的细胞质中，进一步验证了ZmSTK1_USP属胞质类受体蛋白激酶。通过对底物蛋白的筛选发现，ZmSTK1_USP可以特异地与玉米烯醇化酶1相互作用。烯醇化酶是糖酵解途径中催化2-磷酸甘油酸生成磷酸烯醇式丙酮酸的关键酶。糖酵解途径的产物丙酮酸是联系生物体内糖类和脂类代谢的重要中间代谢物。因此，丙酮酸合成存在缺陷可能是导致zmstk1_usp突变体花粉败育的原因。.玉米花粉中enolase1的活力、PEP、丙酮酸、可溶性糖、淀粉和ATP含量进一步验证了此种假设。测定结果表明，zmstk1_usp突变体中烯醇化酶的活力显著降低。磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸、可溶性糖、淀粉、ATP含量均有所降低。通过对ZmSTK1_USP基因在玉米花粉发育中的功能和作用机制的研究进一步丰富了花粉发育的基本理论，为玉米分子育种积累了基因资源。