1600至1820nm波段荧光标记物的三光子作用截面测量及其在生物组织成像中的应用研究

Three-photon (3P) fluorescence imaging in the 1600-1820 nm window has emerged as a valuable tool for deep-tissue imaging, especially for imaging brain tissues in vivo. To increase imaging depth and imaging speed, optimization of the detected fluorescence signal is the key. 3P fluorescence signal is proportional to 3P action cross section, consequently, fluorescent labels with maximum 3P action cross sections should be chosen in imaging applications. However, so far there has been no systematic measurement of 3P action cross sections of various fluorescent labels in this spectral window, hampering the choice of fluorescent labels and quantitative analysis in imaging. Our proposal aims to experimentally measure 3P cross sections of various fluorescent labels, including fluorescent dyes, calcium indicators, fluorescent proteins, etc., in the 1600-1820 nm spectral window. We will build a database of 3P cross sections of various fluorescent labels with the measured results, and apply these results in 3P comparative imaging in biological tissues, such as the mouse brain. Experimentally, we will use a high-energy, tunable femtosecond fiber laser source covering this entire spectral window as the excitation source, and use fluorescence signal intensity measurement to determine the 3P cross sections. Upon completion of this proposed project, the basic physical quantities, i.e., 3P action cross sections of various fluorescent labels can be quantitatively determined. Our measured results, in the form of a 3P cross section database, will find direct application in 3P deep-tissue imaging in the 1600-1820 nm window, offering guidelines for choosing fluorescent labels, optimizing fluorescence signals and quantitative analysis.

1600至1820nm波段三光子荧光成像已成为实现深层生物组织、特别是脑组织成像的重要光学手段。荧光信号强度优化是增加成像深度、提高成像速度的必要条件，它正比于作用截面，因此应当选择具有最大作用截面的荧光标记物。目前为止，还没有对1600至1820nm波段各种荧光标记物三光子作用截面的系统化实验测量结果，严重影响标记物选择以及定量分析。本项目拟在实验上系统测量多种荧光标记物，包括荧光染料、钙指示剂、荧光蛋白等在该波段不同波长处的三光子作用截面，建立作用截面的数据库，并在生物组织，例如小鼠大脑内进行对比成像研究。实验手段上，我们将采用可调谐高能飞秒光纤激光作为激发光源，以荧光信号强度探测为手段，获得三光子作用截面。通过本项目的研究，可以得到多种荧光标记物三光子作用截面这一基本物理量。研究结果将用于三光子深层生物组织成像，为实验中荧光标记物的选择、荧光信号的优化及定量分析提供必要的实验依据。

1700nm波段的三光子成像目前可以获得最大的多光子成像深度。然而，深层多光子信号的耗尽制约了该技术的最大成像深度。为了获得更大成像深度、更快的成像速度，需要对三光子荧光信号进行优化。多光子荧光信号正比于多光子作用截面（吸收截面与量子效率的乘积），因此选取作用截面最大的荧光标记物，或针对固定标记物选择最优激发波长是增强荧光信号最为有效的途径之一。截至本申请项目以前，尚无对1700nm波段荧光标记物三光子作用截面的系统测量，妨碍了标记物以及激发波长的选取。在本申请项目中，立足于1600至1820nm这一深层生物成像组织成像的最佳波段，我们将对该波段适用的多种荧光标记物（主要是红色和橙色）的三光子作用截面进行系统测量，获得作用截面谱，并据此演示其在生物成像中的应用。. 所取得的主要成果为：（1）建造了基于孤子自频移技术，波长覆盖整个1700nm波段（1600nm至1840nm）的可调谐飞秒脉冲光源，作为三光子作用截面测量的激发光源。（2）建造了三光子作用截面测量系统，适合对1700nm波段荧光标记物三光子作用截面谱进行定量测量。（3）利用上述系统，对商品化有机染料、量子点、红荧光蛋白、钙指示剂进行了系统化三光子作用截面谱进行了测量。（4）利用上述系统，对包括聚合物诱导发光材料等在内的新型、非商品化荧光标记物进行了作用截面谱测量，明确新型材料适用于1700nm波段三光子荧光成像。（5）在上述测量结果基础上，对表达荧光蛋白的细胞、被有机染料标记的活体小鼠脑部星形细胞开展了三光子荧光成像。. 本项目的成果在实际应用中将为三光子荧光成像中的荧光标记物选择提供指导，并直接有助于荧光信号优化、成像速度提高以及成像深度进一步提升，从而不断完善1700nm波段三光子荧光成像这一深层生物组织成像利器。