MG53调控程序性坏死复合物RIPK3泛素化在炎症性肠病中的作用及机制

The pathogenesis of inflammatory bowel disease is indeterminate, the central part of IBD treatment is repairing intestinal epithelial cell to rebuild the intestinal barrier. Exercise can improve IBD.MG53 is a myokine newly discovered in recent years which demonstrates protective effects in the injury of heart and skeletal muscle. In our previous study, exogenous recombinant protein MG53 can significantly reduce the necroptosis of intestinal epithelial cells. MG53 is an E3 ubiquitin ligase, and RIPK3 is a key molecules in programmed necrosis with the locus of ubiquitin.MG53 can down-regulate RIPK3 protein expression. Therefore, we hypothesize that: MG53 can modify RIPK3 ubiquitin and accelerate RIPK3 attenuation, finally decrease necroptosis of intestinal epithelial cells and display a protection role in IBD. We will investigate the mechanism of MG53 protective effect in IBD through DSS medicated IBD model, as to provide novel strategies for the prevention and treatment of IBD.

尽管炎症性肠病(IBD)的发病机制尚不清楚，重塑肠道屏障（特别是修复肠上皮细胞）是治疗IBD的中心环节。运动可以改善肠炎，MG53是近年来新发现的肌肉因子，在骨骼肌、心肌等多个器官损伤中均具有保护作用。我们的前期实验发现给予外源性MG53可以明显降低肠上皮细胞的程序性坏死。由于MG53为一种E3泛素连接酶，RIPK3（程序性坏死的关键分子）具有泛素化的位点，MG53改善炎症性肠病的同时明显下调RIPK3蛋白的表达水平。我们推测：MG53通过促进RIPK3的泛素化，加速RIPK3的衰减，抑制肠上皮细胞的程序性坏死，最终达到改善炎症性肠病的作用。本课题拟采用葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导IBD模型，研究MG53调控RIPK3对IBD的影响及机制，并建立工程菌，促进临床转化。本研究有望揭示重塑肠道屏障的新分子，为防治IBD提供新的治疗手段。

一、证明MG53蛋白对炎症性肠病（IBD）具有保护作用，探明MG53通过调控RIPK3泛素化是其主要机制。.1.明确MG53对IBD的肠道保护作用：采用3%硫酸葡聚糖钠（DSS）诱导C57小鼠构建IBD模型，与模型组相比，MG53可显著改善直肠出血指数、体重减轻、粪便评分、疾病活动指数等指标。取小鼠结肠，进行病理学HE染色，镜下可见：DSS处理后，结肠上皮细胞的结构紊乱，全部隐窝和上皮细胞坏死，粘膜、固有肌层及粘膜下层重度炎症，可见大量炎性细胞的浸润。予以MG53处理后上述病理学改变显著改善，组织评分显著降低。免疫组织化学染色发现肠炎小鼠结肠绒毛组织出现倒伏、变形，肠上皮细胞发生大量坏死性改变，而MG53明显向肠上皮细胞富集并显著减少肠上皮细胞的坏死率。.2.明确MG53能抑制IBD肠道上皮组织细胞的凋亡：采用3%DSS诱导C57小鼠构建IBD模型，取小鼠结肠，采用Western Blot的方法，观察凋亡家族caspase8的变化，与DSS实验组，caspase8明显受到抑制，MG53可显著上调caspase8表达，提示MG53可以抑制程序性坏死。建立TNF-α诱导肠道上皮细胞（CaCO2细胞株）的炎性肠病细胞模型，应用流式细胞 Annexin V/PI 染色可见肠道上皮细胞坏死， MG53 处理后上述情况的到明显改善，并通过凋亡染色进一步证实MG53抑制肠上皮细胞的凋亡。.3.明确MG53能显著上调肠道上皮细胞的结构蛋白Occludin、Claudin-1、JAM-A等蛋白，并抑制炎症因子相关蛋白IL1和IL6水平。 .4. 明确MG53与RIPK3的相互作用及机制：建立TNF-α诱导CaCO2的炎性肠病细胞模型，与TNF-α组相比，可见MG53处理后RIPK3的mRNA 表达基本不变，而蛋白表达显著下调，免疫荧光共聚焦检测MG53与RIPK3 在细胞膜及膜周边具有共定位。采用IP观察MG53可显著上调RIPK3泛素化水平，RIPK3泛素化可显著降解RIPK3蛋白，抑制炎症反应，发挥MG53的保护作用。.二、证明ZO-1蛋白是炎症性肠病发病的重要分子，其调控机制与PRSS2基因表达相关。.三、证明盐酸曲美他嗪对脓毒性心肌病具有保护作用，可抑制严重感染导致的心肌细胞坏死。.四、研究成果：发表中文论文1篇，拟发表SCI1篇。