绞股蓝中抗乳腺癌新型达玛烷衍生物的发现及其Wnt/β-catenin信号通路调控机制

Wnt/β-catenin pathway has been proposed as an important pathway for breast cancer metastasis and therapy prognosis. Dammarane-type triterpenes showed notable activities against breast cancer cell proliferation. However, research on its inhibitory mechanism mostly focused on the apoptosis pathway, whereas its effect on Wnt/β-catenin pathway regulation is rarely reported. Our previous chemical investigation on Gynostemma pentaphyllum resulted into the isolation of a series of dammarane-type triterpenes which possess the unprecedented skeleton of ring A and with notable activity on breast cancer cell lines. Preliminary mechanism study showed that this effect is associated with the Wnt/β-catenin pathway. This study aims to screen biological dammarane-type triterpenes from Gynostemma pentaphyllum by using established Wnt/β-catenin pathway screening model with protein tracking method and assistance of modern spectrum techniques and chemical reaction. The expression of C-myc, CyclinD1 and Survivin in the downstream of Wnt/β-catenin pathway was used to evaluate the anti breast cancer activity. The structure activity relationships between novel dammarane-type triterpenes and inhibited breast cancer cells proliferation were discussed. By using human breast cancer xenograft mice, the anti-breast cancer effects and the underlying mechanisms of those compounds will be further evaluated. This project is planning to discover the new anti-tumor lead compounds against breast cancer.

Wnt/β-catenin信号通路参与细胞增殖分化和基因表达等重要生物过程。该通路中的多个成员都与乳腺癌的发生、发展密切相关。达玛烷三萜对乳腺癌细胞增殖有显著的抑制作用，但相关研究多集中于凋亡通路，其调控Wnt/β-catenin通路却鲜有报道。申请人前期首次从葫芦科植物绞股蓝中分离得到具有显著抑制乳腺癌细胞增殖的A环为七元环的新型达玛烷三萜，初步发现它们的作用机制与Wnt/β-catenin通路相关。本课题拟采用Wnt/β-catenin通路为筛选模型，通过蛋白追踪法，并运用多种现代光谱技术和化学反应，对绞股蓝中结构新颖的达玛烷三萜进行系统分离；通过Wnt/β-catenin通路下游蛋白C-myc等的表达水平评价其抗乳腺癌活性；深入探讨结构新颖的达玛烷三萜与抑制乳腺癌细胞增殖的构效关系；以乳腺癌异种移植小鼠为研究对象，对这类成分进行分子生物学机制研究，以期发现高效低毒的抗肿瘤先导化合物。

乳腺癌是世界范围内导致女性癌症死亡的首要原因，是一种威胁全世界女性健康的恶性肿瘤。靶向抗乳腺癌药物分子的发现可以实现乳腺癌的更有效治疗及预防。基于上述背景和思路，在基金的资助下，申请人通过活性追踪对绞股蓝总皂苷及其水解产物进行系统分离，综合运用多种色谱联用手段，从绞股蓝总皂苷及其水解产物中分离并鉴定了74个化合物，其中新化合物46个，发现了2个活性显著且产率高的新型扩环达玛烷型三萜类成分并且对其进行了体内外的机制研究，主要内容及结果如下：.（1）从绞股蓝总皂苷水解产物中分离鉴定了33个化合物（新化合物32个），包括17个A环为扩环的达玛烷型三萜，通过对其波普规律总结，发现其特征信号是C-1，C-3，C-5和C-10位的化学位移值分别为：δC 74，84，130，134。其中GH和GI两个单体成分抑制乳腺癌细胞增殖活性显著且产率高，因此，利用响应面优化法对水解条件进行优化，最大限度上获得单体成分。（2）通过体外机制研究可以看出GH能够通过调控Wnt/β-catenin信号通路中靶蛋白β-catenin的释放及靶蛋白Cyclin D1的表达导致肿瘤细胞周期阻滞并可通过调控线粒体通路诱导乳腺癌细胞凋亡。（3）采用乳腺癌荷瘤小鼠的动物模型，对GH和GI进行体内药效机制研究，结果显示GH和GI均能有效抑制肿瘤的增长，通过转录组学等现代分子生物学技术，发现由于GH作用后降低了PI3K/AKT的磷酸化，抑制了下游靶基因MMP9的表达，从而实现抑制肿瘤的侵袭和转移。另外，GI在裸鼠体内能够调控BMP4的表达，而BMP在Sman缺失或磷酸化被阻止后，能激活肿瘤细胞中Wnt信号通路，从而促进乳腺癌的增殖和侵袭，因此，推测GI可能通过调控BMP4的表达来有效抑制乳腺癌的骨转移。申请人在项目执行后期将继续对该先导化合物进行后续分子水平研究。（4）从绞股蓝总皂苷中分离鉴定了41个化合物（新化合物14个），均为达玛烷型三萜，通过对比乳腺癌细胞毒活性结果发现，扩环达玛烷型三萜活性强于原型结构，推测A环扩环可能是其活性官能团。同时，对得到的绞股蓝皂苷单体成分进行了定性及定量研究。.上述研究结果发表基金标注SCI文章6篇，均为第一作者或者通讯作者。另外在基金的资助下，协助培养博士研究生2名，硕士研究生3名。通过本项目的实施，丰富了抗乳腺癌的药物分子来源，为靶向抗乳腺癌分子的发现及优化提供依据和参考。