乳白耙菌胞壁木质素酶降解木质素的分子机制

Lignin is the second most abundant biopolymer on the earth. Due to the complex and heterogeneous structure of lignin, lignin degradation is considered the rate-limiting steps in carbon cycling on the earth. White rot fungi are the only microorganisms which can completely mineralize lignin and play a key role in natural carbon cycle. Lignin degradation by extracellular ligninase of white rot fungi has been extensively studied, while the details of the biodegradation are not well understood because of the diversity of degradation pathway resulting from the complexity of lignin. The mechanism of lignin degradation by cell wall-associated ligninase other than extracellular ligninase has little been reported. A white rot fungus, Irpex lacteus CD2 can significantly degrade lignin despite low extracellular ligninase activity being detected, but it can produce cell wall-associated ligninase. The aim of the present research is to investigate the distribution of ligninase using proteomic analysis and immunolocalization, and determine the type and characteristics of cell wall-associated ligninase. In order to reveal the molecular mechanism of lignin degradation by cell wall-associated ligninase, the influence of cell wall-associated ligninase from I. lacteus CD2 on the structure and degradation products of enzymatic/mild acidolysis lignin (EMAL) isolated from poplar and poplar itself will be analyse using NMR, AFM, LC-MS/MS, Py-TMAH-GC-MS and so on. The results will be helpful to improve and develop theory of lignin degradation by white rot fungi, and provide a theoretical basis and practical guideline for efficient utilization of agricultural and forestry lignincellulosic waste by white rot fungi.

含量丰富、结构复杂的天然高分子木质素的降解是地球上碳素循环的限速步骤。白腐真菌是自然界中已知的唯一能彻底矿化木质素的微生物，在自然界碳素循环中发挥关键作用。木质素的生物降解涉及多种模式，作用机理复杂多样，尤其是不同于常规胞外木质素酶的胞壁木质素酶的降解机制，尚未展开深入研究。因此，本研究拟以具有胞壁木质素酶的特色白腐真菌—乳白耙菌为研究对象，采用蛋白质组学和免疫组化定位技术分析其在不同结构和组分的基质中木质素酶的种类和分布规律，以明晰胞壁木质素酶的种类，然后采用NMR、AFM、LC-MS/MS、Py-TMAH-GC/MS分析胞壁木质素酶对酶/温和酸解木质素EMAL的结构和降解产物的影响，阐明胞壁木质素酶降解EMAL木质素的机制，并在杨木中加以验证，最终揭示乳白耙菌降解木质素的分子机制，将为白腐真菌木质素降解理论的发展和完善提供科学依据，为农林废弃生物质资源的高效利用提供理论基础和技术支撑。

项目针对乳白耙菌胞外木质素酶活性低，降解木质素能力强，木质素降解酶的种类及其降解机制尚未明晰这些问题，通过基因组测序明晰其木质素酶系组成后，从不同层面探究这些酶降解木质素的机制。取得以下成果：.菌丝原位显色镜检观察发现，菌丝尖端发生过氧化物酶反应，胞壁上检测到MnP活性、强DMP氧化能力和铁还原能力，说明乳白耙菌胞壁可能存在木质素酶系统耦联自由基产生系统协同降解木质素。接着对菌株进行基因组测序，发现乳白耙菌编码62个木质素酶，其中主酶有7个MnP、2个LiP和4个DyP，辅助酶系有纤维二糖脱氢酶1个、芳香醇氧化酶/葡萄糖氧化酶13个、醇氧化酶4个、吡喃糖氧化酶1个、乙二醛氧化酶7个，成簇排列。.转录组分析揭示，乳白耙菌在不同基质中降解木质素的机制不同：木质纤维素中以MnP为主，不仅直接或间接生成三价锰离子氧化低氧化还原电势的酚型木质素模型化合物，还能利用三价锰离子和特定的有机酸反应生成过氧自由基降解非酚型木质素模型化合物；木质素体系中则以DyP为主降解木质素，除了乙二醛氧化酶、吡喃糖氧化酶也是主要的过氧化氢生成酶系。.从乳白耙菌中纯化和在大肠杆菌中表达MnPs验证其功能。重组MnPs能直接或间接利用锰离子氧化酚型木质素结构，还能利用螯合的三价锰离子和有机酸产生•O2-实现非酚型木质素的降解。进一步验证了转录组的结果——乳白耙菌DyP具有降解木质素的功能。DyP纯酶对酚型木质素模型化合物和木质素的降解效果显著，而对非酚型木质素结构的降解较弱，当在降解体系中加入介体1-HBT或乙酰丁香酮时，显著提高DyP对非酚型木质素结构的降解，这一点与Lac作用机制类似。说明DyP兼具Class II型过氧化物酶和Lac的特征。.不同体系中这些关键木质素降解酶的富集和差异性表达，完善与增强了乳白耙菌对不同结构木质素底物的协同降解能力，揭示了乳白耙菌如何响应不同基质降解木质素的分子机制。相关研究成果不仅补充与完善了白腐菌降解木质素的理论体系，而且对于木质纤维素废弃资源的高效利用具有重要的指导意义。