芳香烃降解基因在耐盐菌中的表达及降解动力学研究

高含盐难降解有机污染物废水是当今环境保护面临的一个难题。生物法处理该类废水具有经济、高效、无二次污染的特点，是首选的处理方法。利用基因工程手段，广宿质粒做载体将降解能力较强的芳香烃降解基因导入耐盐菌中，获得底物范围变宽、高稳定性的耐盐降解工程菌，提高高含盐废水中芳香烃化合物降解率。通过降解实验，建立降解动力学模型。优化基因工程菌的发酵条件达到低成本高密度培养和工程菌菌剂制作。该方法不需要通过稀释、反渗透、离子交换、或电渗透等方法降低待处理污水的盐度，同时可以免去驯化的长期过程，相对于野生高效菌株具有更为广泛的底物利用范围等优点。为高含盐难降解有机废水的分子生物学高效处理技术提出一种可行性方法。本项目的实施为高含盐废水行业减少污染物排放量提供新的技术、新的方法，大大减轻对后续城市污水处理厂和受纳水体的污染，保护和改善水体环境。

高含盐难降解有机污染物废水是当今环境保护面临的一个难题。生物法处理该类废水具有经济、高效、无二次污染的特点，是首选的处理方法。本文主要研究内容是利用基因工程手段构建高效降解菌，具体研究成果为：.（1）克隆假单胞菌属的芳香烃关键降解基因苯酚单加氧酶基因和苯酚双加氧酶基因，以质粒pBBR1-MCS和pDK为载体，构建含降解基因的质粒pBBR1-PH12、pBBR1- PH23、pDKP-PH12和pDKP-PH23。.（2）将降解基因导入盐单胞菌 (Halomonas)和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）宿主菌中，构建在高含盐条件下能降解芳香烃的基因工程菌HYX1，HYX2，BYXP1和BYXP2。在含盐3 %，摇瓶培养60h的条件下，4种工程菌对苯酚的降解率分别为65.2%，75.3%，94.3%和89.2%；.（3）将枯草芽孢杆菌的强启动子P43连接到降解基因上，在转录水平对降解基因进行修饰后，将其导入宿主枯草芽孢杆菌中获得基因工程菌BYXP1和BYXP2。在含盐3%，摇瓶培养60h的条件下，经转录水平修饰后的工程菌和未修饰的工程菌对苯酚的降解率分别为94.3%和78.9%。降解率提高了近15.4%； .（4）采用实时定量PCR(Rt-PCR) 、酶标仪等检测手段进行基因水平酶表达量和酶活性的测定，实验结果显示，降解基因转录水平提高了3-4倍，相应的酶活力提高了2-3倍；.（5）通过降解实验，建立降解动力学模型。优化基因工程菌培养基、接种量和发酵条件，在温度为32°C，pH为6-8，转速为180rpm/min的条件下达到低成本高密度培养；.（6）完成了微生物高效菌制剂和多通道生物填料的制作，并成功应用到纺织行业，黏胶废水行业和沿海人工湿地中，进行高含盐环境下有机污染物的去除作用。.分子生物处理技术不需要通过物化等的高成本的稀释、反渗透、蒸发结晶等降低待处理污水的盐度，同时可以免去驯化的长期过程。为高含盐难降解有机废水的分子生物学高效处理技术提出一种可行性方法。本项目的实施为高含盐废水行业减少污染物排放量提供新的技术、新的方法，大大减轻对后续城市污水处理厂和受纳水体的污染，保护和改善水体环境。