细胞壁在Mycolata类微生物摄取转化甾醇过程中的作用研究

Sterols can be converted to pharmaceutical steroids for commercial use by some mycolata strains via catabolism. So far, no pharmaceutical companies in China have successfully developed the technology that can compete with Pfizer. The main disparity is the productivity, which is indicated by the unit concentration of sterols that can be added into the reaction system. The productivity of strains is believed to be closely related to its uptake capacity for sterols. The uptake of mycolata for sterols has been demonstrated to take place via tight contact between the cell wall and the solid sterol particles. This uptake way is closely related to the properties of cell wall, such as lipophicity, permeability and adaptability. All of those properties depend on the special components and structures of cell wall. However, the precise roles of these components and structures are still unclear in the uptake process of sterols. On the basis of our researches for years about the transformation of sterols to steroids by Mycobacterium neoaurum, this study will investigate three predominant components in the mycolata cell walls, i.e. mycolic acids, arabinogalactan and lipoarabinomannan. By genetically manipulating the key biosynthetic genes of these components, we will adjust the components and structures of cell wall and then alter its properties in terms of lipophicity, permeability and adaptability. Subsequently, we will determine the influence of these changes on the uptake and transformation of sterols to steroids and then distinguish the advantageous compositions and structures of cell wall for the uptake of sterols. The aims of this study are to illuminate the effects of cell wall on the sterol uptake of mycolata and to provide the strategies for the development of industrial strains with high productivity of steroids from sterols.

经Mycolata类放线菌的裂解代谢，甾醇可转化为甾体药物。国内还未开发出能与辉瑞公司相匹敌的此项技术，主要差距为菌种的产能，表现为甾醇的单位投料量，而这与菌种对甾醇的摄取能力密切相关。此类微生物对甾醇的摄取是通过细胞壁与甾醇固体颗粒紧密接触实现的，这种摄取方式与细胞壁的亲脂性、渗透性和适应性密切相关，而这些性质则取决于细胞壁的特殊组分和结构，目前还不清楚这些组分和结构在甾醇摄取过程中的具体作用。本申请拟在多年工作基础上，以新金分枝杆菌为模型，对此类微生物细胞壁中的三种主要组分（分枝菌酸、阿拉伯半乳聚糖和脂阿拉伯甘露聚糖）展开研究，通过调控这些组分的关键合成基因，调整细胞壁的结构，改变细胞壁在亲脂性、渗透性和适应性等方面的特点，进而分析这些变化对甾醇摄取和转化的影响，辨别其中有益于甾醇摄取的具体成分和结构，目的是阐释细胞壁在甾醇摄取过程中的作用机制，为开发高产能的甾醇转化菌种提供理论指导。

Mycolata类微生物是细胞壁含有特殊不对称分枝菌酸双层结构的一类放线菌。甾醇是常见的一类疏水化合物，在水中的溶解度低于1μM，一般微生物很难对其有效降解，而Mycolata类微生物却可以直接与甾醇颗粒紧密接触并利用其作为唯一碳源和能源，因此在工业上Mycolata类微生物被开发用于甾体药物的生产，其中以分枝杆菌最为典型。研究表明Mycolata类微生物的细胞壁在甾醇颗粒的摄取与转化过程中扮演着至关重要的角色，在水相体系中是影响甾醇代谢效率的关键所在。以分枝杆菌水相转化甾醇为例，本项目证实一些参与甾醇代谢并定位于细胞壁膜上的氧化酶对于甾醇从细胞外的晶体颗粒向细胞内转运十分关键，此转运过程其实是一个跨细胞壁转运（摄取）和氧化代谢（转化）并行的过程：胆固醇氧化酶是催化甾醇降解的第一步反应，属界面酶，只有结合于膜结构上才能发挥催化活性，本项目证实在新金分枝杆菌中存在两种胆固醇氧化酶ChoM1和ChoM2，前者位于细胞内膜，后者分泌于细胞外且对于甾醇的摄取转化更为重要。在水相中由于疏水作用，甾体颗粒与分枝菌酸双层紧密接触，由于相似相溶，部分甾醇分子可以从甾醇颗粒上解离下来，ChoM2结合于分枝菌酸外层处，可以快速催化甾醇生成甾酮；而部分解离的甾醇，也可能进入细胞膜，ChoM1在细胞内膜则可把这部分甾醇氧化成甾酮。甾醇在双层脂膜中可以均匀稳定地存在，但甾酮却不能，分枝菌酸层生成的甾酮必定会通过转运系统进入细胞内，并会在细胞膜磷脂双层处富集，随后在定位于细胞内膜的3-酮基甾体-C1-脱氢酶等酶的作用下，从磷脂双层解离下来，进入细胞内，并随后进入后续降解代谢过程，并最终在细胞内完成转化。通过对细胞壁中多个组分的分析，本项目证实与甾醇摄取转化关系最为密切的是分枝菌酸，缩减分枝菌酸的长度，干扰其与多糖的组装，可以显著提高细胞壁的通透性，这对甾醇的摄取与转化十分有利，最终我们通过对kasB（参与分枝菌酸碳链延伸），fbpc1和fbpc2（参与分枝菌酸与多糖的组装）3个基因的组合删除，大幅提高了新金分枝杆菌对甾醇的转化效率，使甾醇转化为医药中间体9OHAD的产量提高了50%以上。上述研究从代谢与转运的角度，解析了细胞壁在Mycolata类微生物摄取转化甾醇过程中的关键角色，对于深入理解甾醇的微生物降解代谢有重要的促进作用，从工业应用角度讲，也为开发高产能甾醇转化微生物菌种提供了新思路。