益肾化浊法通过ngn1基因竞争性调控NSCs向神经元分化及其表观遗传学机制研究

Alzheimer's disease (AD) is a kind of regressive disease of central nervous system（CNS）,its pathogenesis is closely ralated with the reduce of neurons in the hippocampus.NGn1, as a key factor, has competitive regulation effect on NSCs differenting into neurons.In previous studies we found that YSHZ method could promote NSCs proliferation and tend to differentiating into neurous.Based on this,this study intend to establish the animal model of AD,interventing with chinese herbs of YSHZ mothed,and observe competitive regulation effect of this mothod on NSCs differentiation by animal behavior、morphology and molecular biology detection.In cell experiments, we further clarify the key target- - ngn1 which this method effect on by siRNA technology. We observe ngn1 related histone modified changes by the methods of co-immunopre -cipitation, and revealed epigenetics mechanism of this method targeted to ngn1 gene.The above experiments will gradually explore the targeted way and effect mechanism of YSHZ method competitivly regulate NSCs differentiating into neurous through ngn1,from the whole to the micro.The purpose is to explore mechanism of chinese medicine prevention and therapy of AD,to develop the Chinese medicine theory "kidney hide fine" ,and provide the evidences for improving the clinical application value.

阿尔兹海默病（Alzheimer's disease，AD）是一种中枢神经系统退行性疾病，其发病机制与大脑海马区神经元减少密切相关。Ngn1作为关键因子具有竞争性调控NSCs向神经元分化的作用。本课题组前期研究发现益肾化浊法可促进NSCs增殖并趋向神经元分化，基于此，本研究拟通过建立AD动物模型，以益肾化浊法中药干预，采用动物行为学、形态学与分子生物学检测，观察该法对NSCs向神经元分化的竞争性调控作用。通过细胞培养，采用siRNA技术进一步明析ngn1基因为该法产生竞争性调控的关键靶点；采用免疫共沉淀法观察ngn1基因相关组蛋白修饰的变化，揭示该法对ngn1基因产生靶向作用的表观遗传学机制。上述实验将从整体到微观逐步探讨益肾化浊法通过ngn1基因竞争性调控NSCs向神经元分化的靶向途径与发生机理，探索中医药防治AD的作用机制，发展中医"肾藏精"理论，为提升其临床应用价值提供部分实验依据。

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一种临床常见的中枢神经系统退行性疾病，已成为21世纪威胁人类的最严重疾病之一, 其发病机制与大脑海马区神经元减少密切相关。前期临床研究发现益肾化浊方可有效改善AD患者的认知功能、精神行为、日常生活能力及中医证候，并具有一定的时效性和较好的远期疗效；前期基础研究发现该作用可能与其促进NSCs增殖并趋向神经元分化相关。而Ngn1作为关键因子具有竞争性调控NSCs向神经元分化的作用，同时在Ngn1基因特异性表达的过程中表观遗传学调控发挥着重要作用。.基于此，本项目采用SD大鼠侧脑室注入Aβ25-35建立AD模型，给予益肾化浊法中药干预，通过Mirros水迷宫、Nissl染色法和免疫组化、Western Blot和RT-PCR法，从行为学、形态学和分子生物学角度上观察益肾化浊法对NSCs分化通路中关键因子ngn1、Tubulin、p-STAT3、GFAP蛋白及基因表达的影响，明确该法对NSCs分化的竞争性调控作用；通过细胞培养，采用siRNA技术建立表达特异性ngn1的慢病毒颗粒，进一步明析ngn1基因为该法竞争性调控NSCs向神经元分化的关键靶点；采用免疫共沉淀方法观察ngn1相关组蛋白H3K9乙酰化和H3K9、H3K27甲基化水平的变化，以揭示该法对ngn1基因产生靶向作用的表观遗传学机制。.通过以上工作得出以下研究结论：（1）益肾化浊法中药可明显改善AD模型大鼠的学习记忆能力，同时上调Tubulin与Ngn1的表达，下调GFAP的表达，提示其作用机制与该法促进NSCs向神经元分化抑制其向星型胶质细胞分化的作用相关；（2）益肾化浊法中药上调Tubulin和下调GFAP表达的作用在被siRNA-ngn1病毒颗粒干扰后的NSCs中无明显体现，明确了该法竞争性调控NSCs向神经元分化的关键靶点为ngn1；（3）益肾化浊法中药对ngn1基因产生靶向作用的表观遗传学机制，与调节相关组蛋白H3K97甲基化水平相关。该结论充分验证了本项目的科学假说。.通过上述研究从整体到微观逐步探讨益肾化浊法通过ngn1基因竞争性调控NSCs向神经元分化的靶向途径与发生机理，探索了中医药防治AD的作用机制，同时为中医“肾藏精”理论的创新提供了现代生物学意义上的解释，为提升其临床应用价值提供了部分实验依据。