西花蓟马传播凤仙花坏死斑病毒循环增值分子机理研究

Impatiens Necrotic Spot Virus（INSV）is an important plant virus, which can cause several disease in various horticultural ornamental and agricultural crops. As the main INSV transmission vector, western flower thrips（Frankliniella occidentalis）plays a decisive role in propagation. However, there have been few studies done on the molecular mechanism of how western flower thrips spread INSV. Especially, how INSV survival and diffusing in vivo of western flower thrips still remains empty. The project plans to reveal the molecular mechanisms of the western flower thrips spread INSV from two aspects. Firstly, we plan to using molecular biology methods such as PCR and PRINS to locate the circulation path of INSV in vivo of western flower thrips. Secondly, we plan to use digital gene expression profiling, phage expression library and the yeast two-hybrid system and other means to clone the key gene involved in the INSV survival and proliferation which in the western flower thrips, and use of site-directed mutagenesis, co-immunoprecipitation method to find out the molecular mechanisms of the combination of protein and virus. Furthermore, explore the related protein function in the process of western flower thrips spread INSV by RNAi methods. The results will reveal the molecular mechanism of the western flower thrips spread INSV and provide a suitable target for the development of drugs to block the spread of the virus.

凤仙花坏死斑病毒（INSV）是一种能够引起多种农业和园艺观赏作物严重病害的植物病毒，作为INSV传播的主要媒介，西花蓟马在INSV 的传播过程中起着决定性的作用。然而，关于西花蓟马传播INSV 的分子机制研究还很少，INSV 在西花蓟马体内存活及扩散的分子机制研究更是空白。本项目计划从以下两方面揭示西花蓟马传播INSV 的分子机制。首先，利用PCR 和PRINS等分子生物学方法对INSV 在西花蓟马体内的循环路径进行定位研究；其次，利用差异基因显示、噬菌体表达文库及酵母双杂交等手段克隆西花蓟马体内参与INSV 存活及扩散的关键基因，利用基因定点突变、免疫共沉淀等方法明确相关蛋白和病毒结合的分子机制，并通过RNAi 等方法探究相关蛋白在西花蓟马传播INSV 过程中的功能。研究结果将揭示西花蓟马传播INSV 的分子机制并可为开发阻断病毒传播的药物提供合适的靶标。

凤仙花坏死斑病毒（Impatiens necrotic spot virus，INSV）是一种能够引起多种农业和园艺观赏作物严重病害的植物病毒，作为INSV传播的主要媒介，西花蓟马Frankliniella occidentalis (The West flower thrips,WFT)在INSV 的传播过程中起着决定性的作用。本研究应用传统生物学、分子生物学、细胞生物学及生物信息学方法，对西花蓟马传播INSV进行研究，结果表明：（1）一龄若虫获毒24h的平均获毒率为93.3%，成虫平均传毒率为80%，最短获毒时间为30min，传毒率随获毒时间的增加而增加，获毒48h，传毒率达到100%；通过TaqMan实时PCR检测发现一龄若虫每5头体内的INSV病毒在100拷贝/μl，随着蓟马的发育，INSV在西花蓟马体内呈指数级扩增，到成虫增加到102拷贝/μl，但西花蓟马体内的INSV病毒不传给子代。（2）通过新一代测序技术对检疫性昆虫西花蓟马的转录组第一次进行了测定，提供了168188个Unigene；我们提供了西花蓟马微卫星分子标记，对研究西花蓟马的扩散和种群差异提供了帮助。（3）利用酵母双杂交核系统对西花蓟马传播INSV的相关蛋白进行研究，筛选到的互作蛋白可能与病毒在西花蓟马中肠的上皮细胞上扩散通过相关，这3个蛋白分别与西方蜜蜂的凝集素类似物蛋白、花蓟马肌动蛋白（actin）和海蠕虫的一种假设蛋白有很高同源性，蛋白功能未知。本实验筛到的与INSV NSm互作的凝集素类似物蛋白可能与西花蓟马病毒识别有关，另外actin蛋白可能与西花蓟马病毒在中上皮细胞扩散有关。筛选得到的3个介体蛋白，并没有获得预期结果，可能是因为病毒蛋白与介体蛋白的互作并没有确定位置。