细胞周期调控激酶Cdk对Wnt信号通路的调控机制研究

Wnt通路是一条在进化上高度保守的信号通路，它在胚胎发育中起关键作用。Wnt通路相关因子的缺失和异常将导致发育不全或相关疾病。Dapper1和Dishevelled是Wnt通路中关键的作用蛋白。我们的前期研究表明，细胞周期调控激酶(Cdk)在Wnt信号刺激下，可磷酸化Dapper1及Dishevelled。在本项目中，我们将进一步结合多种生物化学，细胞生物学方法和实验技术，深入研究磷酸化修饰在细胞周期调控及Wnt信号通路中的作用机制。并且，通过动物实验进一步观察Dapper1和Dishevelled的磷酸化在相关疾病及胚胎发育过程中的作用。通过本项目的开展，我们希望阐明细胞周期调控和Wnt信号通路交互（cross-talk）的分子机理及其在胚胎发育及相关疾病中的作用。

本人严格按照年度计划进行了本项目的研究，目前任务书中的研究内容基本完成，取得了如下的成果。.我们首先进行了细胞周期调控激酶（Cdk）对hDpr1和Dvl蛋白的磷酸化鉴定研究。已经成功鉴定出能被Cdk磷酸化的,hDpr1的2个磷酸化位点，并探讨了磷酸化对Wnt信号通路的影响。为了观察hDpr1的磷酸化对Wnt信号通路的影响，利用定点诱变PCR技术，制备了一系列的hDpr1的不能被磷酸化的非磷酸化突变体（hDpr1-SXA, SYA, SX,YA）和模拟磷酸化的突变体（hDpr1-SXD, SYD, SX,YD）。利用一系列的突变体通过Wnt报告基因表达的影响，验证了Cdk对hDpr1抑制Wnt信号的作用具有抑制作用。同时，发现这种磷酸化还直接影响细胞周期的进程。.另外，我们还探讨了Dvl蛋白的磷酸化。但是因为Dvl蛋白的磷酸化位点非常多，利用质谱的方法验证位点有一定难度，这一研究仍在进行中。但是我们利用软件分析方法预测了可被Cdk磷酸化的潜在位点并对其功能进行了研究。我们在研究中主要采用了抑制剂和干扰的方法，在细胞水平上观察了Cdk对Dvl2的磷酸化及其功能的研究。我们发现，Cdk的抑制剂Roscovitine预处理HEK 293T细胞1个小时，明显抑制了Wnt3a CM刺激诱导Dvl2蛋白的磷酸化及抑制了Wnt报告基因的表达。另外，特异性敲除Cdk1, 2对Dvl2蛋白的磷酸化及Wnt报告基因表达的影响结果表明，Cdk2直接影响Dvl2蛋白的磷酸化以及Wnt信号通路。同时，还利用激活型的Cdk2及抑制型的Cdk2质粒观察了对Dvl2蛋白磷酸化的影响。发现激活型Cdk2在细胞水平上能增强Dvl2的磷酸化。通过免疫共沉淀的方法我们还观察到Dvl2和Cdk2在细胞内的相互作用。而且，有趣的是，这些Dvl2蛋白的磷酸化是周期依赖性地发生，分裂期Dvl2蛋白的总量及磷酸化水平均显著性地下调。并且，Dvl2将参与细胞周期的进程中影响周期的进行。基于软件预测的潜在磷酸化位点，我们制备了一系列的突变体，发现磷酸化能够增强了Wnt信号通路。.以上研究结果表明，Cdk可以通过磷酸化hDpr1和Dvl蛋白影响Wnt信号通路，hDpr1和Dvl反过来还参与到细胞周期中影响周期的进程，形成Wnt信号与细胞周期间的交互。