向日葵锈病菌种内群体分化及SCAR标记

近年来我国向日葵种植面积不断扩大，但由于病害流行等原因，我国向日葵生产波动较大，急需强有力的科技支撑。向日葵锈病(Puccinia helianthi Schw.)是向日葵上重要的病害之一，世界范围内均有发生，在我国的种植产区为害亦日趋严重。该病菌种内群体分化明显，遗传背景复杂，全世界已报道过该菌的80多个生理小种，我国也发现该菌存在生理小种分化现象。为摸清该菌在我国的发生状况和遗传背景，准确的进行小种鉴别，采用致病性测定、RAPD技术对该菌进行研究，明确我国向日葵锈菌的生理小种组成及品种抗病性情况，揭示我国向日葵锈菌的遗传多样性；并在对向日葵锈菌种内群体遗传分析的基础上，对与小种和地理群相关联的特异性RAPD片段，将其转化成SCAR标记。这将为向日葵的抗锈病育种及合理选用抗病品种奠定基础；为该病原种群的监测、病害的流行预测提供技术支持。

本研究对中国北方向日葵主产区的向日葵锈菌进行了生理小种鉴定研究，对2010年7～9月份在黑龙江、内蒙古东部、中部、西部、河北、陕西、宁夏、新疆等地采集有典型锈病症状的病叶，收集病叶上的夏孢子，进行单孢子堆分离扩繁获得44个纯化菌系。利用三联密码系统命名法，将诸菌系接种于9个国际标准鉴别寄主，确定了6个生理小种：300、310、500、724、735、737；出现频率分别为59%、16%、14%、7%、2%、2%，结果显示300号小种为主要优势小种；将优势小种300接种于选取自各主要产区的44个代表性向日葵品种，表现感病的12个，抗病的31个，其中油葵品种中感病的占15%左右，食葵品种中感病的占39%，杂交种中感病的占31.6%，常规品种中感病的占80%。.运用RAPD技术对44份菌样进行遗传多样性检测，从40条随机引物中筛选出13个多态性高、稳定性好的引物，对每个样品的基因组DNA进行扩增，共获得115个RAPD位点，其中多态位点91个，多态率为79.1%。聚类图分析结果显示菌样间遗传相似系数在0.63~1.00之间，平均值为0.815，表明菌样间具有丰富的遗传多样性；数据显示在0.74遗传相似系数下，供试菌样可分为3个RAPD群，表明菌样遗传类型与菌样地理来源并不具有一定的相关性。.通过对我国44个菌样的RAPD规模筛选，发现S8引物（ACGGATCCTG）可扩增出主要优势小种300号的长度为305bp的特异片段，对特异性片段进行回收、克隆、测序，再用DNAMAN软件设计一对SCAR特异性引物（上游：5’-CCTGAGGAAGACGGTATT-3’，下游：5’-CCTGCATGCCATTGGTGTT-3’），合成后对不同来源的300号小种进行SCAR检测，结果显示该专化SCAR标记可适用于300号小种的检测。.运用特异性引物ITS1-F与ITS4-B对纯化锈孢子、感病植株、健康植株进行特异性扩增，则扩增结果不受寄主向日葵和其他菌物DNA的影响。核糖体ITS区段的研究表明，我国向日葵锈菌的ITS序列高度保守，并不适合该菌种内群体分化的研究。采自国内各个不同地区的菌系经测试，所有的ITS序列无任何差异，ITS区段（包括ITS1、ITS2、5.8rDNA）长度为556bp，而我国菌系与其他国家菌系ITS序列的主要差异表现在个别位点碱基的颠换上。