狭叶柴胡与内生真菌代谢交流对柴胡皂苷合成的影响

The main bioactive compounds of Bupleurum scorzonerifolium Willd. are Saikosaponins, which have anti-inflammatory, antidepressant and anticancer activities. It was proved that endophytes can produce the same bioactive compounds as their host plants, and they are associated with the synthesis of the plant bioactive compounds. Therefore, six strains of endophytic fungi, which can produce the similar components to host plant, were isolated from Bupleurum scorzonerifolium Willd. Among them, two endophytes can produce saikosaponin. However, the ability of saikosaponins synthesis was attenuative or lost after two successive subcultures of endophytic fungi. We supposed that there might be exist metabolic communication mechanism between the endophytes and Bupleurum scorzonerifolium Willd.. The communication mechanism could influence the secondary metabolism of both endophytic fungi and their hosts. The co-culture model of Bupleurum scorzonerifolium Willd. and the endophytic fungi has established for elucidation of the communication mechanism. In order to reveal the effect of the metabolic communication on saikosaponin biosynthesis, the expression of saikosaponin biosynthesis gene both in endophytic fungi and Bupleurum scorzonerifolium Willd., the role of Ca2+, cAMP, MAPK in signal pathway and the function of transcription factors(LaeA)in fungal saikosaponin synthesis will be tested. This project will provide a new way for the synthesis of saikosaponins in artificial fermentation, new methods for biosynthesis of effective compounds and for new medicinal resource exploration, and new ideas for study of the reason for geo-authentic crude drugs formation.

柴胡皂苷为柴胡的主要药效成分，具有抗炎、抗抑郁、抗肿瘤等功效。研究表明，内生真菌能产生与宿主相同的药效成分，且许多植物中活性化合物的合成与内生真菌有关。本课题组前期从狭叶柴胡中筛选了6株产生与宿主相同成分的内生真菌，其中2株能够合成柴胡皂苷。然而我们发现，分离的内生真菌独立培养2代后产柴胡皂苷的能力迅速减弱。我们推测，内生真菌与宿主之间可能存在某种代谢交流机制，这种机制会影响狭叶柴胡及其内生真菌的（次级）代谢。本课题组建立了柴胡与内生真菌共培养的模型，拟在共培养过程中观察柴胡皂苷合成基因表达的变化、检测Ca2+、cAMP、MAPK等信号通路分子在交流中的作用，分析LaeA与真菌柴胡皂苷合成途径之间的调控关系，进而揭示内生真菌与柴胡代谢交流对柴胡皂苷合成的影响。为利用生物技术合成中药有效成分提供新途径，为指导人工发酵生产柴胡皂苷和开发新的中药资源提供新方法，并为探索道地药材成因提供新思路。

本研究利用柴胡与其内生真菌代谢交流的共培养模型，采用ELISA、qPCR、转录组学和HPLC检测技术，结合响应面分析法阐明了柴胡与其内生真菌代谢交流机制以及代谢交流对柴胡皂苷合成的影响。研究发现1）柴胡宿主和其内生真菌经多个信号通路的进行相互识别和应答。柴胡宿主交流通路包括PI3K-Akt、AMPK、ErbB、mTOR等信号通路。内生真菌交流的通路包括MAPK、凋亡、HIF-1、cAMP、细胞循环等信号通路。多信号途径交流有助于宿主与内生菌间在复杂的环境条件下能够及时有效沟通。2）柴胡宿主和其内生真菌通过多个代谢途径的进行彼此代谢调控。柴胡宿主参与交流的代谢途径包括缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、真核生物核糖体的生物发生、2-氧羰基水杨酸等代谢途径。内生真菌参与交流的代谢途径包括糖酵解/糖异生、柠檬酸循环、赖氨酸降解、烟酸与烟酰胺等代谢途径。多代谢途径交流体现了植物宿主与内生真菌在共生过程中的彼此妥协、平衡和互助。3）代谢交流使柴胡宿主及其内生真菌柴胡皂苷d产量提高。交流使柴胡宿主及内生真菌中与柴胡皂苷d合成密切相关基因上调。柴胡宿主上调基因包括柴胡皂苷和成关键酶基因β-AS、IPPI、FPS、SS、萜类骨架合成基因、倍半萜类化合物基因、三萜类合成基因和P450基因。内生真菌上调基因包括柴胡皂苷合成关键酶基因HMGR、IPPI、FPS、SS和GTs、萜类骨架合成基因、倍半萜类化合物基因、三萜类合成基因和P450基因。结合化学分析表明代谢交流有助于柴胡和其内生真菌的柴胡皂苷d产量提高。上述结果解释了“为什么柴胡内生真菌独立继代培养产柴胡皂苷能力减弱”的问题，证实了我们提出的：“宿主植物-内生真菌间通过代谢交流对彼此次级代谢进行调控”。这一理论为指导人工发酵生产柴胡皂苷提供新方法，为开发新的中药资源提供新途径，并为探索道地药材成因提供新思路。