洋葱果胶甲酯酶基因(AcPME)的功能研究

Pectin methyl-esterase (PME) is a cell wall protein, participated in a variety of physiological processes in plants, fungi and even insects. In the research of onion (Allium cepa) fertility differential gene expression, we found that a 350-bp fragment is always expressed in fertile materials, and cloned its coding sequence. The results of the protein sequence alignment showed that it has pectin methyl-esterase domain, belonging to a member of the pectin methyl-esterase superfamily.This gene was named pectin methyl-esterase of Allium cepa (AcPME). The main contents of this research: 1) Transcriptional analysis of onion pectin methyl-esterase gene promoter; 2) PME activity of different types flowering buds; 3)Heterologous expression and biochemical activity of AcPME protein; 4)Subcellular localization AcPME protein; 5) The function research of reverse genetics about AcPME gene. At present, only we reported a paper of onion pectin methyl-esterase gene expression in the journal of Plant Breeding, no reports on the onion pectin methyl-esterase gene function. The researches are great significance for the relation of AcPME gene and fertility, mechanism of action and the biological functions of AcPME protein , but also great significance to explore the mechanism of pollen development genes in onion.

果胶甲酯酶[Pectin methylesterase (PME)]是一种细胞壁蛋白，广泛存在于植物、真菌甚至昆虫中，参与多种生理过程。我们在研究洋葱育性相关基因差异表达的过程中，发现一个大小约为350bp的片段始终只在可育材料中出现，克隆了其编码序列。蛋白质序列比对显示，该基因表达的蛋白具有果胶甲酯酶结构域，属于果胶甲酯酶超家族成员。本研究主要内容为1）洋葱果胶甲酯酶基因启动子转录特性分析；2）花期不同育性类型花蕾的AcPME活性比较；3）AcPME蛋白的异源表达和生物化学活性；4）AcPME蛋白亚细胞定位；5）AcPME基因的反向遗传学功能研究。目前,国内外均未见对洋葱果胶甲酯酶基因功能的报道，该项研究对于洋葱PME基因与育性的关系、AcPME蛋白的生物学活性和功能具有重要意义；而且在探索洋葱花粉发育基因的作用机制上具有重要意义。

果胶甲酯酶是一种细胞壁蛋白，广泛存在于植物、真菌甚至昆虫中，参与多种生理过程。我们在研究洋葱育性相关基因差异表达的过程中，发现一个大小约为350bp的片段始终只在可育材料中出现，克隆了其编码序列。蛋白质序列比对显示，该基因表达的蛋白具有果胶甲酯酶结构域，属于果胶甲酯酶超家族成员。.本研究主要内容为1）洋葱果胶甲酯酶基因启动子转录特性分析；2）花期不同育性类型花蕾的AcPME活性比较；3）AcPME蛋白的异源表达和生物化学活性；4）AcPME蛋白亚细胞定位；5）AcPME基因的反向遗传学功能研究。.本研究工作的主要进展和所取得的研究成果包含以下4个方面：(1) 阐明了洋葱果胶甲酯酶基因AcPME启动子的转录特性。可育的AcPME启动子p1210P是一个花粉或花粉管特异性启动子，仅在花期的花粉粒或花粉管中强烈表达，非花组织中不表达。不育的p118P启动子无法启动GUS基因的转录，不具有启动子的功能。（2）获得了AcPME异源表达蛋白，明确了蛋白的生物化学活性及结构域蛋白的互作。生物活性分析表明，pGEX4T-1-PME蛋白具有果胶甲酯酶活性，其1μg纯化蛋白约为0.008U商品化蛋白P5400，而PMEI结构域可以特异性的抑制自身PME蛋白活性，其抑制能力约为0.001U的P5400，然该PMEI不能抑制外源果胶甲酯酶P5400的活性。PULL DOWN试验证明了AcPME蛋白PMEI结构域可以和PME结构域互作。保持系和恢复系内源PME蛋白具有相似的活力单位数分别0.014U和0.013U，而不育系具有非常高的PME活性约为0.026U。(3) 明确了AcPME基因的亚细胞作用部位。构建了AcPME C端融合AcGFP亚细胞定位载体pROK2-AcPME-AcGFP，AcPME基因定位于细胞周质中。（4）探明了AcPME基因的反向遗传学功能。成功的获得了洋葱再生体系和遗传转化体系，证明了AcPME的表达为花粉是否发育的结果，是由于花粉的正常发育导致了AcPME基因的表达；在正常可育植株中干扰AcPME基因的表达，不能造成该植株的雄性不育。而AcPME正义和干扰载体转化拟南芥均造成了拟南芥的雄性不育。.目前，国内外均未见对洋葱果胶甲酯酶基因功能的报道，该项研究明确了洋葱PME基因与育性的关系；在探索洋葱雄性不育与育性恢复，以及花粉发育相关基因的作用机制上具有重要意义。