生物钟蛋白CLOCK缺失引发癫痫的机制及其治疗初探

There is no effective treatment that is currently available for intractable epilepsy whose pathogenesis remains largely unclear. Our recently published study on surgical samples from patients with intractable focal epilepsy had demonstrated that the expression of Circadian Locomotor Output Cycles Kaput (CLOCK) was significantly decreased in epileptogenic tissue. We have created a genetically modified mouse model with a selective deletion of CLOCK in excitatory neurons in the cortex (Emx cre; Clock flox/flox）and the animals develop spontaneous seizures, possibly due to the reduction of dendritic spines, and less inhibitory inputs than excitatory inputs in excitatory neurons. In the current study, we propose to use Emx cre; Clockflox/flox mice to study molecular mechanisms of CLOCK regulation by answering three questions: 1) what downstream genes of CLOCK have been affected that lead to the reduction of dendritic spines? 2) what are the changes among different subtypes of inhibitory interneurons regarding their number, morphology and neural circuits? 3) can small molecules that were proved to strengthen the CLOCK signals rescue the defect of neural circuits? We hope our study will provide new insights into the underlining pathogenesis and eventually lead to the development of novel therapeutics for intractable epilepsy.

顽固性癫痫仍缺乏有效的治疗措施，发病机理也尚未完全清楚。我们最近发表的研究发现：生物钟蛋白CLOCK在顽固性癫痫病灶组织中的表达明显降低；并且通过动物模型将小鼠大脑皮质兴奋性神经元的CLOCK基因敲除（Emx cre; Clock flox/flox）后，小鼠有自发性癫痫；其中原因可能是兴奋性神经元的树突棘明显减少，并且其抑制性神经输入的减少多于兴奋性神经输入的减少。本课题将以CLOCK敲除小鼠为动物模型，通过回答以下几个问题来深入研究其中的分子机理。1）哪一些CLOCK的下游基因发生了变化，并且可以引起神经元的树突棘的减少？2）抑制性神经元在亚型、数量、形态和神经环路方面分别有什么变化？3）改善“分子时钟”下游基因表达的小分子是否会逆转CLOCK缺失而引起的神经环路不平衡？该研究希望通过对“分子时钟”CLOCK和神经环路的研究，寻找新的顽固性癫痫的治疗途径。

癫痫是由于大脑内神经元异常同步放电而导致脑功能短暂异常。临床目前用于治疗的抗癫痫药物对上有三分之一的癫痫患者不能有效控制症状，成为药物难治性癫痫。药物治疗或手术治疗后的癫痫患者常伴发记忆力受损，注意力下降，抑郁焦虑等，严重影响生活质量。因此迫切需要更多研究来探究癫痫的发病机制，寻找新的有效的预防和治疗靶点。.愈来愈多的研究表明癫痫和生物钟节律密切相关。CLOCK作为生物钟核心蛋白有重要的作用，但与癫痫相关研究甚少。我们在前期研究经RNA芯片技术发现癫痫患者的病灶组织中CLOCK蛋白表达明显减少，而且呈现细胞类型特异性，在兴奋性神经元中比抑制性神经元中减少更明显。研究发现脑内兴奋性神经元中CLOCK敲除的小鼠在脑电记录中有自发性癫痫发作以及癫痫造模过程中缩短癫痫发作潜伏期。为完善CLOCK蛋白在癫痫中的功能，我们构建了特异性抑制性神经元中CLOCK基因敲除小鼠（GAD-Cre;Clockflox/flox）模型。我们的研究结果发现：.1.行为学实验可见GAD-Cre;Clockflox/flox小鼠有抗抑郁样和记忆力增强的行为表现。CLOCK蛋白可能会影响情绪和认知能力。.2.结合癫痫行为观察，脑电图以及免疫荧光染色可见小鼠抑制性神经元中CLOCK敲除会缓解匹罗卡品诱导的癫痫发作，有抗癫痫的作用。.3.GAD-Cre;Clockflox/flox小鼠大脑中BDNF和ARC蛋白的表达增加。抑制性神经元中CLOCK基因敲除会影响突触可塑性。.4.小鼠癫痫模型中发现改善“分子时钟”下游基因表达的小分子药物可以抑制癫痫的发作。.综上，本研究进一步探讨CLOCK蛋白在癫痫中的作用机制，抑制性神经元中CLOCK基因敲除可能通过改变突触可塑性从而影响情绪认知以及缓解癫痫发作。这为癫痫的临床治疗提供了新的靶点和思路。