ATM 反义转录本L1-ATM-AS在乳腺癌发生中的作用和机制研究

One of the major challenges in breat cancer treatment resides in the fact that breast cancer, especially for three negative breast cancer, is a highly heterogeneous disease at the molecular level and its pathogenesis is not yet fully understood. As a key switch molecule in DNA damage response, ATM plays an important role in the carcinogenesis and development of breast cancer. Expression patterns of the ATM gene in mammary tissues associations with breast cancer survival，but the mechanism of its expression regulation is not yet clear. In the previous work, we identified a chimeric transcription located at the antisense of ATM gene, designated L1-ATM-AS. We found that L1-ATM-AS was down-regulated in breast cancer cells and tissues, showing a positive correlation with the expression of ATM. Knockdown of L1-ATM-AS results in significant decrease in ATM mRNA and protein level in normal breast epithelial cells. Therefore, the scientific hypothesis is put forward: L1-ATM-AS participate in the carcinogenesis and development of breast cancer by regulating ATM expression. The aim of this study is exploring the functional role of L1-ATM-AS in the occurrence and development of breast cancer and the mechansim. Furthermore，summarize the clinical relevance and prognostic value of L1-ATM-AS for breast cancer from the retrospective analysis of tissue samples. This study is for the better understanding of pathogenesis of breast cancer and provides a new way for searching the potential therapeutic targets and markers for prognosis.

乳腺癌尤其是三阴性乳腺癌具有高度异质性，因其发病机制尚未完全明确，治疗效果往往不佳。ATM作为DNA损伤修复过程中起关键作用的开关分子，在乳腺癌发生中起了重要的作用，且直接影响患者的预后，但其表达调控的机制尚未明确。申请者在前期工作中鉴定出了位于ATM基因反义链的转录本L1-ATM-AS，其在乳腺癌组织样本中L1-ATM-AS与ATM的表达呈正相关，且干扰L1-ATM-AS将降低ATM的mRNA和蛋白质表达水平。由此提出科学假设：L1-ATM-AS可通过调控ATM，参与乳腺癌的发生发展过程。本项目在前期工作基础上，拟在细胞和动物模型中证实这一科学假设并进一步探讨L1-ATM-AS调控ATM表达的机制和在乳腺癌发生发展中的功能，同时从组织样本回顾性分析中总结L1-ATM-AS对于乳腺癌的临床相关性和预后判断价值。为更好的理解乳腺癌的发病机制，寻找潜在治疗靶点和预后标志物提供思路。

ATM基因是细胞DNA损伤反应的主要调节因子。ATM表达失调在乳腺癌中很常见，并且与癌症的发生和预后有关。然而，其表达调控的潜在的机制仍不清楚。本研究发现了一种新的位于ATM基因反义链的转录本L1-ATM-AS。与正常乳腺组织和乳腺上皮细胞系相比，在乳腺癌组织样本中和乳腺癌细胞系中，L1-ATM-AS表达水平降低，且与ATM的表达水平呈正相关；在细胞中干扰L1-ATM-AS表达可降低ATM的mRNA和蛋白质表达水平。在探究 L1-ATM-AS 对 ATM 表达的可能调控机制时，我们发现虽然 L1-ATM-AS与ATM 的外显子有重叠区段，但利用 RNA 酶保护实验确定 L1-ATM-AS与ATM的mRNA不存在互补结合。而干扰L1-ATM-AS表达可抑制ATM启动子区活性，因此我们假设L1-ATM-AS可能通过介导调控蛋白与ATM启动子区的结合发挥调控作用。通过DNA拉下实验 （pull-down assay）和质谱检测，我们筛选得到结合在ATM启动子区且其结合量受L1-ATM-AS表达影响的备选蛋白KAT5。ChIP和RIP实验结果表明，L1-ATM-AS可通过将KAT5组蛋白乙酰转移酶招募到ATM基因启动子，显著上调ATM基因活性。在体外实验中，L1-ATM-AS水平降低可导致ATM表达异常下调，并损害ATM介导的体外正常乳腺细胞DNA损伤修复。同时，临床标本的检测显示L1-ATM-AS水平与乳腺癌患者预后呈正相关。综合上述结果，我们的研究表明L1-ATM-AS是ATM表达和功能的重要正调节因子。揭示了乳腺癌中ATM基因失调的一种可能机制，也丰富了对反义转录物调节其互补基因机制的理解。