无标记定量共聚焦位相显微技术

Quantitative phase detection is of important significance in life science. Although confocal microscopy has been widely used in cellular study, it cannot obtain the phase information of the specimen directly. Through differential contrast interference (DIC), phase information can be extracted. Yet, DIC has a nonlinear relationship between the intensity and the phase. Also, it requires two-dimensional detector, which is incompatible for confocal microscopy. By using laser oblique scanning optical microscopy (LOSOM), we have successfully combined confocal fluorescence microscopy with phase imaging. In this application, we proposed a novel quantitative phase imaging method based on LOSOM. Taking advantage of the linear relationship between the phase derivative and the intensity in Schilieren partial-obstruction microscopy, we designed two schemes: 1) Using a dual-shutter obstructer in XY axes, the four local derivatives can be collected; 2) Using a fluorescent plate loaded with four different kinds of quantum dots, the four local derivatives can be obtained by spectral collection. Then, through solving the linear equation to obtain the phase of the specimen. This work can push LOSOM from qualitative phase microscopy to quantitative phase microscopy, taking advantage of the linear relationship between the phase and the intensity in LOSOM. As LOSOM is highly compatible with confocal microscopy, the proposed method can achieve dual modality imaging combining both quantitative phase microscopy and quantitative fluorescence microscopy.

定量位相探测在生命科学研究中具有重要意义。虽然共聚焦显微技术已经在细胞研究中得到广泛应用，但是它无法直接获取细胞位相信息。利用差分位相干涉可以获取位相信息，但其光强-位相关系为非线性；同时它需要利用二维探测器，无法直接与共聚焦技术兼容。我们通过激光斜射扫描显微技术(LOSOM)，成功将共聚焦荧光成像与位相成像相结合。在本申请中，我们提出一种基于LOSOM的定量位相成像技术。利用Schlieren共聚焦部分遮挡能够获取位相一阶偏导数的特点，我们设计了两种实现位相成像的方案：1）利用XY轴的快门光阑实现四个方向的偏导数测量；2）利用一个载有四种不同发光光谱的量子点荧光编码板实现四个方向的偏导数测量。然后，通过求解线性方程实现反推位相。这一工作能够充分利用LOSOM技术与位相导数直接相关的特点，实现LOSOM从定性到定量成像的进展。本工作将实现定量位相与定量荧光双模态成像。

本项目针对传统成像技术难以获得准确定量位相的问题，以及显微成像中分辨率受到衍射极限制约的问题，从多个角度进行了研究，具体工作如下：1. 双光子Schlieren位相成像技术。传统的双光子成像无法实现位相的获取。通过Schlieren成像技术，并将其与上转换荧光板结合，通过检流计扫描成像，我们获得了精确的光强-位相定量关系，并将其应用于对细胞的定量位相成像。这一工作近期发表于Appl. Opt.期刊。 2. 利用高掺上转换纳米粒子，我们利用高掺UCNP可以在808nm照射下实现光子雪崩效应，极大地降低受激辐射的阈值。我们利用30mW的激光实现了28nm的分辨率。这一工作于2017年发表在Nature期刊。3. 为了进一步降低STED功率，我们利用镜面反射与入射光形成干涉，将轴向点扩展函数压缩到100nm，实现了轴向分辨率的6倍提升，同时在STED上得到了2倍的分辨率提升。我们得到了19nm的分辨率，并首次观察到了细胞核孔内环的环状结构，和病毒丝蛋白的壳层结构。这一工作发表在Light: Science and Applications上(IF=13.6)，并得到了Nature Photonics的亮点报道。 4. 我们发展了一种新型的、基于偏振的超分辨技术。由于荧光的偶极子特性，探测偶极子方位能够更为精确地描述蛋白的排布。我们利用激发光调制，实现了偶极子映射超分辨，能够对活细胞进行动态观察。这一工作发表在Light: Science and Applications上，并得到了Nature Methods的亮点报道。 同时，利用金纳米颗粒表面增强拉曼散射效应 ，我们实现了对SERS纳米粒子的偶极子方位角的测量，这一工作近期发表在Nanoscale期刊。5..通过综合性利用量子点的发光特性，我们实现了量子点在基于受激辐射的超分辨、结构光照明、基于闪烁统计的超分辨、和单分子定位等超分辨技术中的应用，覆盖了目前几乎所有的超分辨技术。这一工作发表在ACS Photonics上。.上述工作得到Nature Photonics, Nature Methods，Chem期刊等的亮点报道，并得到诺贝尔奖得主朱棣文教授在内的多名国际知名教授的多次引用和高度评价。已授权美国专利1份，中国专利4份。申请人同时获得美国光学学会高级会员和北京市基金委杰出青年基金。