重寄生真菌盾壳霉胞外蛋白酶的分离纯化与生防功能研究

The biocontrol agent Coniothyrium minitans is a mycoparasite of Sclerotinia sclerotiorum. It can parasitize sclerotia of S. sclerotiorum, reducing apothecial production and hence disease incidence. Our previous studies showed that C. minitans secreted a lot of proteases in the infection process, and the production of proteases by C. minitans was regulated by carbon sources, nitrogen source and ambient pH. So far, types of C. minitans extracellular proteases, mechanisms involved in proteases production by C. minitans, and the biocontrol function of proteases remain unknown. In this project, we proposed to purify C. minitans extracellular proteases, to study the proteases properties, to clone the proteases genes and confirm the function, to analyze the expression patterns of proteases genes in the process of C. minitans mycoparasitic, to express the proteases in Saccharomyces cerevisiae and determine the biocontrol function of proteases, to create efficient parasitic strain of C. minitans. The objective of this project is to reveal the biocontrol function of proteases in the process of C. minitans mycoparasitic. The results will broaden our understanding of the mechanism of C. minitans mycoparasitic, and also will be useful for genetically improving biocontrol efficacy of C. minitans against S. sclerotiorum.

生防菌盾壳霉是核盘菌的重寄生菌。它通过寄生核盘菌菌核，减少初侵染来源，从而取得防病效果。我们前期研究结果表明：盾壳霉在重寄生过程中大量产生蛋白酶，而且蛋白酶的产生受碳氮源和环境pH值调控。目前，对盾壳霉胞外蛋白酶的种类、产生调控机制、及其生防功能等问题都不明确。本项目提出对盾壳霉胞外蛋白酶进行分离纯化，研究其酶学特性；克隆蛋白酶基因，研究在重寄生过程中的表达模式；通过基因敲除/互补试验和酵母表达系统研究蛋白酶在盾壳霉重寄生过程中的功能；最后构建高效寄生特性的盾壳霉工程菌株。项目的完成将揭示盾壳霉胞外蛋白酶在重寄生过程中的功能，有助于认识盾壳霉的重寄生机制，同时也为提高盾壳霉重寄生效果开辟新途径。

生防菌盾壳霉是核盘菌的重寄生真菌，盾壳霉在寄生核盘菌菌核过程中分泌大量蛋白酶，而且蛋白酶的产生受碳氮源和环境pH调控。本项目系统研究了盾壳霉胞外蛋白酶CmSp1的酶学特性和生防功能，取得了以下研究进展：(1) 明确了盾壳霉胞外蛋白酶的产生条件及酶活影响因子，发现核盘菌菌核浸出液能诱导盾壳霉产生胞外蛋白酶，盾壳霉蛋白酶对苯甲基磺酰氟（PMSF）敏感，说明盾壳霉分泌的胞外蛋白酶可能主要是丝氨酸蛋白酶；(2) 采用简并引物对丝氨酸蛋白酶基因进行了克隆，获得了受核盘菌菌核提取物诱导上调表达的丝氨酸蛋白酶CmSp1和CmSp2的基因序列，这两个基因均属于Subtilisin-like S8超家族，含有两个钙结合位点和催化三联体（Asp/His/Ser）；(3) 明确了CmSp1的表达模式，发现CmSp1的表达受转录因子CmpacC和CmlaeA的正调控，CmpacC和CmlaeA的缺失显著降低了盾壳霉胞外蛋白酶的产生，通过Split-Marker方法对CmSp1和CmSp2进行了敲除，CmSp1突变体的胞外蛋白酶活性显著降低，证实CmSp1在盾壳霉重寄生过程中起重要作用；(4) 采用毕赤酵母表达系统表达了CmSp1，在甲醇诱导60小时达到最高活性12.39 U/ml-1，CmSp1酶促反应的最适温度为40℃，最适pH为7，SDS-PAGE分析CmSp1分子量为45 kDa，CmSp1对核盘菌和灰霉菌有抑菌活性；(5) 构建了蛋白酶CmSp1超表达的工程菌株，证实超表达CmSp1能增强盾壳霉的重寄生能力；(6) 对CmSp1的降解靶标蛋白进行了分析，通过SDS-PAGE和质谱分析，共鉴定核盘菌靶标蛋白564个；(7) 通过盾壳霉与核盘菌互作的转录组分析，明确了盾壳霉在重寄生过程中重寄生相关酶（几丁质酶、葡聚糖酶、蛋白酶等）基因表达的时间动态，筛选到一批上调表达的重寄生相关酶基因。项目取得的结果明确了盾壳霉胞外蛋白酶CmSp1的酶学特性、表达调控机制和生防功能，揭示了蛋白酶CmSp1在盾壳霉与核盘菌互作过程中的作用，获得了重寄生能力增强的CmSp1超表达的工程菌株，为提高盾壳霉的生防效果和遗传改良提供了新途径。项目实施4年来发表论文5篇，其中SCI论文1篇，核心期刊论文2篇，国内会议论文2篇，在国内学术会议上作专题报告3人次，培养了3名硕士研究生， 2名博士研究生。