基于细胞糖链原位编辑的末端单糖类似物导入及其对EGFR信号通路的抑制作用研究

Epidermal growth factor receptor (EGFR) plays important roles in tumor formation, proliferation and metastasis. The terminal monosaccharides (α2,3-sialic acid and α1,3-fucose) on EGFR glycans is closely related to EGFR activation. It is reported that the EGFR signaling is obviously suppressed in tumor cells with hypersialylation or hyperfucosylation. In this project, we will start from synthesing a series of sialic acid analogs and fucose analogs. Then different combination of sialic acid analogs and fucose analogs will be incorporated into cellular glycans in Lec2 cells expressing wild type or mutant EGFR by different in situ glycan editing (ISGE) strategies, followed by MS analysis of immunoprecipitated EGFR for evaluation. Further, the effects of different ISGE strategies on EGFR signaling will be studied by observing the change of EGFR dimerization, EGFR phosphorylation, and activation of downstream molecules after ISGE. The ISGE strategies with obvious inhibition on EGFR and selective depression on EGFR mutant will be screened. Finally, the screened ISGE strategies will be applied to cultured human lung cancer cells (A549 and H1975) and zebrafish xenograft model to study the effects on cancer cell migrations. The results will provide a basis for developing novel anticancer drugs targeting EGFR.

表皮生长因子受体（EGFR）参与了肿瘤的形成、增殖和转移过程，EGFR糖链末端单糖（α2,3-唾液酸和α1,3-岩藻糖）的水平与EGFR激活密切相关。研究表明，高度唾液酸化或岩藻糖化的肿瘤细胞中EGFR信号通路明显受到抑制。本项目拟从系列唾液酸和岩藻糖类似物的合成出发，采用细胞糖链原位编辑技术，依次在细胞膜糖链上导入唾液酸和岩藻糖类似物，并利用质谱分析技术对编辑效果进行评价，然后通过western blot技术研究不同组合唾液酸和岩藻糖类似物对Lec2细胞上野生型和突变型EGFR信号通路的影响，筛选对EGFR信号通路具有显著抑制性和对突变型EGFR具有选择性抑制作用的糖链编辑方案，最后通过细胞实验和异种移植斑马鱼模型评价这些方案对人肺癌细胞A549和H1975在体外和体内迁移的抑制作用。本研究将为靶向抑制EGFR的抗肿瘤药物的开发提供新的思路。

表皮生长因子受体（EGFR）是重要的肿瘤治疗靶标。对突变型EGFR的选择性成为当前靶向 EGFR 药物开发的关注热点。EGFR糖基化与EGFR激活密切相关。本研究从系列唾液酸和岩藻糖类似物的合成出发，采用细胞糖链原位编辑技术，依次在细胞膜糖链上导入唾液酸和岩藻糖类似物，然后研究不同组合唾液酸和岩藻糖类似物对肺癌细胞上野生型和突变型EGFR信号通路的影响，筛选对EGFR信号通路具有显著抑制作用的糖链编辑方案，通过细胞实验评价其对人肺癌细胞A549和H1975的抑制作用。从而为研究非天然糖基化对EGFR的调控提供了新的工具和依据。. 首先合成3种CMP-Sia类似物和6种GDP-Fuc类似物作为糖链原位编辑的糖供体。从乙酰甘露糖胺和岩藻糖开始，化学合成2种乙酰甘露糖胺类似物和4种岩藻糖类似物，然后酶法合成相应的CMP-Sia和2种类似物，以及GDP-Fuc和5种类似物。其次对双重糖链编辑（DuGE）方法进行了验证与优化。通过生物正交反应和流式细胞术分析不同编辑条件下新增唾液酸或岩藻糖的含量以确定最佳反应条件。研究发现先进行唾液酸化不会影响后续的岩藻糖化信号，但先岩藻糖化会抑制后续的唾液酸化信号。CD15s（sLex）流式和细胞成像实验显示只有先进行唾液酸编辑，再岩藻糖编辑后，sLex的信号才能显著增强，意味着LacNAc二糖转变为sLex四糖。. 然后在A549肺癌细胞上实施了28种系列DuGE并筛选出对EGFR信号通路有较强抑制作用的四种DuGE方案。即Sia+FucAz、SiaAl+FucAl、SiaAz+FucDB、SiaAz+FucOMe，并通过伤口愈合实验验证了对迁移的抑制作用。在表达EGFRT790M 的H1975肺癌细胞上实施了4种筛选出的DuGE，结果显示SiaAz+FucOMe组合对突变型EGFR具有抑制性，并通过伤口愈合实验进行了验证。. 最后对一类新型的岩藻糖类似物——硫酸化岩藻糖进行了研究。以L-半乳糖开始，首次化学合成了全乙酰化6-硫酸岩藻糖，并初步探索了其在岩藻糖编辑中的应用。. 综上所述，本文成功建立了DuGE的方法，利用制备的3种CMP-Sia类似物以及6种GDP-Fuc类似物，成功筛选出对EGFR信号通路兼具抑制性与选择性的DuGE组合，为开发靶向抑制EGFR的抗肿瘤药物研究提供新的思路。