一个核糖体小亚基蛋白在植物配子体发育与精卵识别中的作用研究

In our previous work,we confirmed ANK6-SIG5 interaction plays a key role in male-female gametes recognition in plant double fertilization. By yeast two-hybrid approach, we identified a ANK6-interacted small ribosomal subunit protein, designated RPS9. RPS9 was also located in the mitochondria. The gene expression pattern and mutant phenotype are similar with those of ANK6 in that both genes are preferentially expressed in male and female gametophytes, and both mutants displayed empty seed-sets in the siliques with abnormal female gametes, suggesting that RPS9 could regulate the transcription initiating activity of SIG5 to stimulate expression of specific mitochondrial protein by interacting with SIG5 directly or indirectly via the adaptor protein ANK6, and finally control the development of female gamete and male-female gamete recognition. This project will focus on the role of RPS9 on female gamete and male-female gamete recognition by genetic, biochemical and transcriptomics. This work will be significant in disclosing the mechanism of ANK6-mediated signal pathway in female gemate development and male-female recognition.

我们的前期工作证实了ANK6与SIG5蛋白互作在植物精卵识别中起关键作用(Yu et al,2010)。通过酵母双杂等手段，鉴定到一个与ANK6互作的核糖体小亚基蛋白RPS9。RPS9也定位于线粒体，其基因表达模式和突变体植株的表型也与ANK6和SIG5相似，即在雌、雄配子体中优势表达、突变体果荚中现空座位、以及雌配子体发育发生缺陷等，暗示RPS9很可能通过ANK6这个接头蛋白直接或间接与SIG5相互作用，调控SIG5的转录起始活性并激发线粒体中特定蛋白的表达，最终控制植物雌配子体的发育或精卵细胞的识别。在此基础上，本项目拟通过遗传、生化及组学等手段，研究RPS9在植物雌配子体发育或精卵识别中的作用。该研究结果对于揭示ANK6介导的植物雌配子体发育或精卵识别中的信号通路分子机制具重要意义。

本课题组在前期工作中鉴定到ANK6参与生殖调控过程，通过酵母双杂筛到核糖体小亚基蛋白RPS9M。核糖体作为细胞内蛋白质翻译机器对维持细胞的正常功能起着非常关键的作用，但是拟南芥核糖体小亚基蛋白RPS9M在植物体内行使什么样的生物学功能还未见报道。. 利用酵母双杂交和双分子荧光互补系统（BiFC），证实RPS9M能够与ANK6相互作用，且互作发生在线粒体。发现RPS9M C端结构域与ANK6直接互作，而N端调控C端互作的强弱。. 构建了RPS9M-GFP转基因植株，用线粒体红色荧光染料MitoTracker进行共定位，将RPS9M定位于线粒体。. 利用GUS报告基因对RPS9M的表达模式进行了分析。RPS9M主要在生殖发育过程中有很高的表达，同时在营养生长阶段也有一定量的表达。. 对基因敲除突变体rps9m-1和rps9m-2表型分析发现影响了雌、雄配子体的发育以及种子的形成。RPS9M缺失会响极核的融合以及中央液泡的发育。突变的胚囊对花粉管的吸引以及雌、雄配子的融合并无影响，但对随后的胚和胚乳发育产生严重影响，最终导致突变体种子败育。弱突变体rps9m-3胚和胚乳的发育均比野生型缓慢，且部分rps9m-3突变胚的形态建成异常，早期胚胎发育过程中顶细胞的异常分裂以及胚柄顶端细胞的纵向分裂，导致子叶发育异常。RPS9M突变影响拟南芥种子的萌发，根、叶、茎的生长。. rps9m-3突变体中线粒体核糖体26S rRNA与18S rRNA含量的比值出现明显的偏离，突变体内ROS含量明显高于野生型，且AOX1a和NDB4的表达显著上调，表明RPS9M突变影响线粒体的功能。. 综上所述，RPS9M不仅在植物的生殖发育过程中起着非常关键的作用，而且对根、茎、叶等营养器官的生长产生一定的影响。这些功能可能主要是通过RPS9M与ANK6相互作用调节线粒体核糖体的功能，进而影响线粒体基因表达最终影响线粒体的功能来实现的。